原代肾小球系膜细胞的分离培养

（一）实验目的

肾小球系膜细胞及系膜基质定位于肾小球毛细血管襻间，它们除能支撑毛细血管外，还能发挥其他重要生理作用。例如，通过系膜细胞自身收缩及产生的血管活性物质调控肾小球血流；通过吞噬及降解作用清除从血浆沉积至系膜区的大分子物质；通过分泌生长因子调节细胞外基质合成、降解，参与系膜基质更新。在病理条件下，系膜细胞与其他肾组织细胞一样，不但是疾病的受害者，而且也是直接参与者，它能通过自身细胞增殖及转分化，产生各种炎症介质、致纤维化物质及其抑制物而影响疾病过程。掌握体外培养原代系膜细胞技术，对研究肾脏疾病发病机制具有十分重要作用。

（二）实验试剂

1.15%FBS RPMI1640。

2.Ⅴ型胶原酶（0.5mg/ml）。

3.系膜细胞培养液　15%FBS RPMI1640培养液100ml中加上325μl胰岛素（终浓度为5μg/ml）。

（三）实验流程

1.取新鲜肾组织，用无菌4℃生理盐水冲洗，剥离肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块。

2.放入重叠的三层不锈钢筛网（孔径为250μm，106μm，75μm）。

3.在最上层筛网上用消毒针筒轻研肾皮质，同时用4℃生理盐水冲洗，使其滤入下层筛网（106μm），用生理盐水冲洗这一道筛网（同时轻研组织）。

4.组织漏入75μm这层筛网时，尽量只冲不研磨，吸出少许组织，镜下观察，若见纯净小球（98%纯度）即可停止冲洗，收集此层组织移入离心管，见图1-4。

5.800r，3min，弃上清，离心管中酌情加入2～3mlⅤ型胶原酶，在37℃孵箱充分消化15min。

6.边消化边观察，以肾小球中有细胞散出但又不破碎为适度，用10%FBS RPMI1640培养液终止消化。

7.800r，2～5min，收集肾小球置培养瓶中孵育。培养的系膜细胞，见图1-5。

（四）细胞鉴定

细胞鉴定采用间接免疫荧光方法鉴定培养细胞，抗结蛋白抗体为阳性。见图1-6。

图1-4　光镜下纯净肾小球（×100）

图1-5　光镜下培养的肾小球系膜细胞（×100）

图1-6　荧光显微镜下肾小球系膜细胞抗结蛋白抗体阳性（×400）

（五）注意事项

1.选择新鲜、青年肾组织，分离提取的原代系膜细胞生长效果比较好。一般取6～8周大鼠肾组织。

2.镜下观察组织十分重要，要保证收集肾小球的纯度。

3.分离好的肾小球放置培养瓶中3d内不要移动，利于肾小球贴壁生长。

参考文献

[1]Ronco P,Ardaillou R,Baud L,et al.Biology of renal cells in culture.In:Grenner BM,ed.The Kidney,7th ed,VolⅠ.Philadelphia:Saunders.2004;105-198.

[2]Rodriguez-Barbero A,L’Azou B,Cambar J,et al.Potential use of isolated glomeruli and culture mesangial cell as a in vitro models to assess nephrotoxicity.Cell Biol Toxicol,2000,16:145-153.

[3]Lee GS.Mesangial cell culture:its role in the understanding of the pathogenesis of glomerular disease.Ann Acad Med Singapore,1995,24:851-855.

[4]于力方，陈香美，黎磊石，等.正常人肾小球系膜细胞培养的研究.中华肾脏病杂志，1990,6:70-74.

[5]段永刚，陈香美，等.Ⅰ型胶原、内皮素对肾小球内皮细胞及系膜细胞产生细胞外基质的影响.细胞生物学杂志，1995,17:48.

[6]蒋工伟，陈香美，黎磊石，等.血清促肾因子对肾小球系膜细胞生长的影响.中华肾脏病杂志，1990,6:367-368.

[7]陈香美，田劲，黎磊石，等.小鼠肾小球系膜细胞白介素1β基因表达的研究.中华医学杂志，1991,71:11-13.

[8]林洪丽，陈香美，傅博，等.正、反义组织金属蛋白酶抑制剂1基因转染对肾小球系膜细胞凋亡及相关基因表达的影响.中华医学杂志，2001,81:411-414.

[9]Chen XM,Wang JZ,Fu B,et al.RGD-Containing Peptides Trigger Apoptosis in Glomerular Mesangial Cells of Adult Human Kidneys.Biochemical and Biophysical Research Communicatoins,1997,234:594-599.