成体干细胞培养技术（大鼠骨髓间充质干细胞）

（一）概述

骨髓间充质干细胞（bone marrow derived Mesenchymalstem cells，BMSCs）是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。BMSCs在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，并且这些细胞经过20～30个培养周期，仍能保持其多向分化的潜能。

不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前BMSCs的分离方法主要有全骨髓培养、离心培养法、细胞表面分子标记分选法等。其中最常用的为全骨髓培养。我们以大鼠骨髓间充质干细胞为例，介绍全骨髓培养法。

（二）实验目的

成体干细胞（adult stem cells，ASC）具有干细胞的共性，即自我更新及多向分化的能力。在适宜条件下，可分化为成骨细胞、肌肉细胞、上皮细胞、神经细胞和脂肪细胞等。鉴于ASC具有向多种细胞组织分化的潜能，取材方便、分离培养技术简单，近年来作为细胞疗法及组织工程的种子细胞已受到普遍关注。成体干细胞在急、慢性肾损伤的应用基础研究以及作为生物人工肾种子细胞的研究是肾脏病治疗学的前沿技术。

（三）实验试剂

1.配制培养基（以200ml培养基为例）

（1）原代MSCs培养基　　170ml　α-MEM+30ml胎牛血清。

（2）传代MSCs培养基　　180ml　α-MEM+20ml胎牛血清。

2.诱导分化所需试剂配制

（1）成骨诱导液（表1-10）。

（2）成脂诱导液（表1-11）。

表1-10　成骨诱导液

表1-11　成脂诱导液

3.染色所需试剂配制

（1）油红染色所需试剂

1）油红储存液：称取0.5g油红干粉，溶于100ml异丙醇中，配成0.5%油红储存液，棕色瓶保存。

2）油红工作液：油红∶去离子水＝3∶2，滤纸过滤，室温放置10min。

3）其他：10%中性甲醛、PBS、异丙醇。

（2）Von Kossa染色法所需试剂

1）2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100ml。

2）5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100ml。

3）其他：4%多聚甲醛、PBS、双蒸水。

（3）茜素红染色法所需试剂

1）0.1%茜素红水溶液：茜素红0.1g蒸馏水加至100ml，Tris-Hcl调整pH至8.3。

2）其他：95%乙醇、双蒸水。

（四）实验流程

1.原代培养　消毒后，无菌操作下取幼鼠股骨、胫骨，置于装有α-MEM的培养皿中，小心将表面肌肉剔除。用剪刀剪断两侧干骺端，将2ml注射器插入骨髓腔内将骨髓冲出至原代MSCs培养液中（放于一个培养皿，共3ml培养液）。用注射器反复吹打，制成单细胞悬液。24h换液：吸出培养皿中原有培养液，加入新的培养液7ml。观察细胞形态后，置于培养箱，以后每3d换液。大鼠MSCs镜下观察呈梭形。

2.传代　细胞融合至70%时传代。吸出旧培养液，加入2ml胰酶（覆盖住培养皿），室温3min（镜下观察细胞消化情况），约有70%细胞变圆悬浮即可加入等量的传代培养基终止消化。吸管轻轻吹打后，置入离心管离心（1500r，5min），弃上清，加入传代培养基，按1:2传代培养。

3.冻存　消化步骤同前，离心（1500r，5min），弃上清，加入冻存液。-20℃3h，-70℃过夜，最后液氮保存。

4.复苏　液氮中取出细胞后，在37℃水浴中快速摇动，至冰晶溶解。吸取冻存液加入离心管，加入10倍体积培养液混匀，离心（1500r，5min），弃上清，重悬后加入培养皿，加入7ml培养液，置于培养箱中，24h换液。

5.成骨诱导及染色（图1-11，图1-12）

诱导液每3d更换一次。

6.成脂诱导及染色（图1-13）

诱导液3d→维持液1d（培养液+胰岛素）→诱导液3d→维持液1d→诱导液7d。

（五）注意事项

1.取幼鼠股骨、胫骨时注意无菌操作。冲出骨髓后，需用注射器反复吹打成单细胞悬液，利于细胞贴壁。换液时动作轻柔，以免将已经贴壁的细胞吹起。

2.传代时控制细胞消化时间在2～3min内，可使细胞纯化。

3.诱导液及染色液最好现用现配，以免失效。

图1-11　Vonkossa染色

图1-12　茜素红染色

图1-13　成脂染色