流式细胞仪检测细胞凋亡

（一）PI单染色法

1.基本原理　根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变，利用流式细胞仪进行检测。

2.试剂与仪器　PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100μg/ml。用棕色瓶4℃避光保存。70%乙醇，400目筛网，流式细胞仪。

3.实验流程

（1）收集细胞（数目为1～5×106个/ml），500～1000r离心5min，弃去培养液。

（2）3mlPBS洗涤1次。

（3）离心去PBS，加入预冷的70%的乙醇固定，4℃，1～2h。

（4）离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

（5）400目筛网过滤1次，500～1000r离心5min，弃去PBS。

（6）用1mlPI染液染色，4℃避光30min。

（7）流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析FS对侧散射光的散点图。

（8）结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，FS降低，而SS可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一个亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45。

4.注意事项　细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

（二）Annexin V（锚定蛋白）/PI双染色法

1.基本原理　细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

2.试剂与仪器　细胞凋亡试剂盒中包含binding buffer、Annexin V和PI。检测仪器为流式细胞仪。

3.实验步骤

（1）细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1～5）×106/ml500～1000r离心5min，弃去培养液。

（2）用PBS洗涤细胞两次，用binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度达到1× 106/ml。

（3）取100μl的细胞悬液，加入5μl的Annexin V和5μl的PI，室温下避光孵育10～15min。

（4）再向试管中加入400μl的binding buffer。

（5）细胞悬液筛网过滤后，上机检测。

（6）流式细胞仪分析：FITC和PI的激发光波长为488nm，FITC的最佳发射波长为520nm，用525nm滤光片，PI发射波长630nm，用630nm滤光片检测。

（7）结果判断：凋亡早期，细胞膜完整，对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则没有抗染性。因此细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染，产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双参数散点图上，左下象限显示活细胞，为（Annexin-V-FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即晚期凋亡细胞，为（Annexin-V-FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（Annexin-V-FITC+/PI-）。见图1-22。

4.注意事项

（1）一定要计数细胞，过多过少，染色结果皆不准确，影响上机。

（2）要用筛网滤过细胞，防止成团细胞堵塞管路。

（3）利用对照组细胞做好仪器补偿。

5.典型图例　以RMC的纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）表达受抑制后（图1-22），及应用雷帕霉素处理后的凋亡表现（图1-23）。

6.常见问题及处理方法

（1）为什么理论上细胞应该凋亡，但实际上机后发现凋亡数量不多呢？

答：对于贴壁细胞的凋亡研究，在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。

（2）为什么我上机检测时细胞很少？

答：为了减少细胞丢失，染色、分析时建议使用聚苯乙烯管。其他类型的试管（如聚丙烯管），会使细胞在管壁堆积，造成细胞丢失，并影响染色效果。洗细胞后，建议轻轻摇匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。

（3）细胞需要固定吗？

答：必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定。

图1-22　FN表达受抑制后，RMC的凋亡情况

FL1.AnnexinV；FL2.PI

图1-23　应用雷帕霉素处理后的RMC凋亡表现

0代表正常对照组；1、2、4、8、16分别代表1、2、4、8、16ng/ml雷帕霉素组

（4）我的实验为什么细胞坏死那么多？

答：可能原因是在消化或吹打时，有些细胞（如原代培养的细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。解决方法是：最好先低速离心，吸取细胞培养瓶中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次。用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。

（5）胰酶配方中是否含有EDTA？

答：由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。

（6）如何设置对照组？

答：必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。就是单染FITC-Annexin V及单染PI的细胞。

参考文献

[1]Wu D,Chen X,Guo D,et al.Knockdown of fibronectin induces mitochondria-dependent apoptosis in rat mesangial cells.J Am Soc Nephrol,2005,16:646-657.

[2]傅博，张四方，卓莉，等.雷帕霉素对肾小球增殖及凋亡的影响.中华肾脏病杂志，2009,25:849-852.