【摘要】：PBS缓冲液，Tween-20，脱脂牛奶，Triton-X100，4%多聚甲醛，一抗，二抗，共聚焦专用皮氏培养皿等。PBS洗涤5min×3次。
（一）实验目的
研究细胞特定蛋白分布定位。
（二）主要实验材料
PBS缓冲液，Tween-20，脱脂牛奶，Triton-X100，4%多聚甲醛，一抗，二抗，共聚焦专用皮氏培养皿（petri皿）等。
（三）实验流程
1.培养细胞使之状态良好，传代至共聚焦专用petri皿中，待细胞长至70%～80%为宜。
2.固定 4%多聚甲醛，先常温固定3min，然后4℃，15min（或4%多聚甲醛4℃固定30min）。然后PBS洗涤5min×3次。
3.透化 0.1%TritonX-100，室温透化20min。然后PBS洗涤5min×3次。
4.封闭 5%BSA室温封闭20min。
5.一抗 用包含1%BSA的PBS或免疫荧光专用一抗稀释液按1∶100稀释抗体（根据染色结果可调整一抗稀释浓度），每孔加入100μl，37℃2h，或4℃过夜。PBS洗涤5min×3次。
6.二抗 按1∶200～1∶1000稀释，加入皿中，室温1h。PBS洗涤5min×3次。
7.加入PBS1ml或甘油200μl于中间玻璃孔，然后上镜观察。
8.激光扫描 根据二抗标记，选择合适波长激光及荧光接收通道，扫描图像。
（四）注意事项
1.注意各级抗体浓度的使用范围。
2.荧光抗体孵育时要注意避光。
3.注意各步骤的漂洗要充分。
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