（一）实验目的
研究细胞多种蛋白及组分的分布定位及相互关系。
（二）主要实验材料
1.两种一抗 不同种属不同指标，以小鼠抗波形蛋白（mouse-Vimentin）和羊抗-E-钙粘蛋白（goat-E-cadherin）为例。
2.两种二抗 选择同一种属来源的抗体，例如：用驴抗小鼠IgG-FITC抗体（Donkey anti-mouse IgG-FITC）；驴抗羊IgG-Cy3抗体（Donkey anti-goat IgG-Cy3）。
3.DAPI储存液 70%乙醇溶解，浓度100μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可4℃下长期保存。
4.PBS缓冲液，Tween-20，脱脂牛奶casin，Triton-X100，4%多聚甲醛。
5.共聚焦专用petri培养皿等。
（三）实验流程
1.细胞在共聚焦专用培养皿中培养，生长70%～80%融合。
2.吸出Petri皿中的培养液，PBS洗3遍。
3.固定 4%多聚甲醛4℃固定30min，每皿1ml。
4.PBS洗5min×3。
5.透化 0.2%Triton-X100室温透化10min。
6.PBS洗5min×3。
7.封闭 1×casin室温封闭30min。
8.吸出残余封闭液，加入用抗体稀释液或PBS稀释一抗混合液（Vimentin1∶50；E-cadherin1∶100），4℃过夜或37℃2h。
9.PBST（含0.1%Tween-20的PBS）洗10min×3。
10.加入混合好的二抗（mouseIgG-FITC1∶200；goatIgG-Cy31∶200），用抗体稀释液或PBS稀释。室温孵育1h。
11.PBST洗10min×3。
12.将DAPI储存液用PBS稀释1000倍，加入Petri皿中，室温孵育15min。
13.PBST洗10min×3。
14.加入PBS1ml或甘油200μl于中间玻璃孔。然后上镜观察。
15.选择405nm（DAPI），488nm（FITC），559nm（Cy3）为激发波长，蓝、绿、红三通道接收，采用顺序扫描（sequential scan）模式，顺序采集相应图像，用分析软件进行三色图像叠加。
（四）典型举例
见图1-25。
图1-25 腹膜间皮细胞Vimentin/E-cadherin/细胞核多重染色（×600）
红色代表E-cadherin；绿色代表Vimentin；蓝色代表细胞核
（五）注意事项
1.两种一抗必须来源于不同种属。
2.染色反应最好在湿盒内进行，以免标本干燥。染色试剂的干燥是造成非特异性染色反应的原因之一。
3.染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜（pH约7.4）。因此，冲洗液及抗体稀释液均应注意酸碱度的调整。
4.样本经染色后，应及时观察并照相，不宜长期保存，以免褪色。荧光标本在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30%。
5.抗体稀释度以获得最佳染色效果，背景非特异性染色最小为标准，因此对每一批抗体必须预实验摸索，找出最佳稀释度。
6.为防止抗体效价下降，所购抗体应及早实验，并应尽量减少抗体溶液的冻融次数。
7.若非特异性染色过强时，在染色反应前应先将荧光抗体离心，去除沉淀物后再使用。
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