（一）实验目的及原理
细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。对细胞微管-微丝-细胞核进行多重荧光染色，能观察其定位及其相互关系。
（二）主要实验材料
1.本实验采用间接免疫荧光法标记微管，一抗为兔抗微管蛋白抗体（Rabbit antitublin antibody）。
2.二抗为FITC-anti-Rabbit IgG。
3.用四甲基异硫氰酸罗丹明标记的次毒蕈环肽（TRITC-phalloidin）标记微丝。
4.用Hoechst33258标记细胞核。
5.骨架蛋白缓冲液（Cytoskeleton Buffer，CB）或加入蔗糖（CBS），pH6.1，成分组成：10mmol/LmES，138mmol/LKCl，3mmol/LmgCl，2mmol/LEGTA，0.32msucrose。
6.PBS，TritonX-100，BSA等。
7.共聚焦专用petri皿等。
（三）实验流程
1.将培养于petri皿中的贴壁良好的细胞用37℃预热的PBS洗两次，加入4%甲醛/CBS4℃固定20min。
2.PBS洗涤5min×3，再用CBS浸泡水化1h。
3.用含有0.2%Triton X-100的PBS液，透化细胞10min，PBS洗涤5min×2。
4.加入5%BSA/PBS封闭1h。
5.PBS洗涤5min×3。
6.加入Rabbit anti-tublin antibody（用5%BSA/TPBS1∶100稀释），置于湿盒室，室温孵育30min。
7.PBS洗涤5min×3。
8.加入稀释于5%BSA/PBS中的5μg/mlHoechst33258和TRITC-phalloidin，室温孵育20min。
9.PBS洗涤5min×3，加入2mlPBS上镜观察。
10.启动FV1000共聚焦显微镜系统，设定激发波长364nm、488nm、543nm，三通道蓝、绿、红分别采集细胞核、微管、微丝荧光图像，采用顺序扫描的方法解决光谱交叉干扰的问题，获得清晰地定位图像。
（四）典型举例
RMC细胞骨架染色，见图1-27。
图1-27 肾小球系膜细胞骨架染色
红色代表微丝；绿色代表微管（×600）
[1]Chen X,Li Z,Feng Z,et al.Integrin-linked kinase induces both senescence-associated alterations and extracellular fibronectin assembly in aging cardiac fibroblasts.J Gerontol a-Biol,2006,61:1232-1245.
[2]Paddock SW.Confocal Microscopy Methods and Protocols.New Jersey:Humana Press,1999:chapter 11.
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
