【摘要】：细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。细胞可以通过自噬，消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器、变性蛋白质与核酸等生物大分子。它既可以抵御病原体的入侵，又可保卫细胞免受细胞内毒物的损伤。在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病的发病中具有十分重要的作用。本方法可定量检测细胞内自噬体的形成，为研究自噬提供技术。
（一）实验目的
细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。细胞可以通过自噬，消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器、变性蛋白质与核酸等生物大分子。为细胞的重建、再生和修复提供必须原料，实现细胞的再循环（Recycling）和再利用。它既是体内的“垃圾处理厂”，也是“废品回收站”。它既可以抵御病原体的入侵，又可保卫细胞免受细胞内毒物的损伤。在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病的发病中具有十分重要的作用。本方法可定量检测细胞内自噬体的形成，为研究自噬提供技术。
（二）实验材料
吖啶橙（Acridine Orange，AO，1mg/ml储存液）染料、Hank’s液，共聚焦专用petri皿等。
（三）实验流程
1.细胞在共聚焦专用培养皿中培养，生长70%～80%融合。
2.实验前用Hank’s液洗3次。
3.在无血清培养液中加入AO，使其终浓度为2～5μg/ml，每皿细胞加入2ml。
4.37℃5%CO2孵箱孵育15min。
5.Hank’s液洗3次后，孵箱中放置10min。
6.共聚焦显微镜选择激发波长488nm激光，选择510～530nm（绿色）和650nm（红色）通道观察。
7.每个样品内随机选取8～10个视野，共计100个细胞，存储图像，用于定量测定其荧光强度和分布面积。
（四）典型举例
衣霉素处理足细胞后的自噬现象，见图1-31。
图1-31 足细胞用衣霉素处理10h后，胞内自噬溶酶体染色
红色颗粒为自噬溶酶体（×600）
（五）注意事项
激光功率尽量开的小，能观察到细胞即可，过强的激光将损伤细胞，增加自噬溶酶体的表达。
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