细胞胞浆及线粒体

（一）实验目的及原理

钙离子是生命活动最重要的离子之一，通过测定细胞内游离钙离子浓度，我们可以得知肌肉收缩、神经信号传导、细胞间通讯、激素反应等生命活动的重要信息。细胞内游离钙离子与信号转导以及细胞的各种病理生理现象密切相关，因此动态检测活细胞内游离钙离子具有非常重要的意义。

Fluo-3-AM能够测定各种活细胞胞浆钙，可以被氩离子激光（Argon-ion laser）的488nm激光激发。Fluo-3进入细胞后能够可逆地与胞内游离钙结合，荧光强度反应胞内钙离子浓度。Fluo-3和钙离子结合后荧光变化较大，这就能够对钙离子浓度变化变得更加灵敏。同时，Fluo-3和钙离子的结合能力较弱，这样能够检测到细胞内更高浓度的钙离子水平。

Rhod-2-AM用来测定各种细胞线粒体内的钙离子，线粒体膜内外存在较大的电位差，线粒体膜内为负，Rhod-2-AM是一种多价离子，可有效地在线粒体内聚集、水解，其荧光强度可如实地反映线粒体内钙离子的水平，Rhod-2-AM是长波长荧光指示剂而不受细胞本身荧光的干扰。

（二）主要实验材料

Fluo-3探针；Rhod-2探针；人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelialcell，HUVEC）；PBS缓冲液等。

（三）实验流程

1.将HUVEC细胞种于chamber slide（8孔）上；用无血清的MEM同步12h。

2.将储备的Fluo-3（1mmol/L）用含Ca2+，Mg2+的PBS缓冲液稀释到终浓度7.5μmol/L。

3.加100μl/孔，置37℃的培养箱中孵育30min。

4.将染色后的样品用PBS洗2次。

5.置于60倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。

6.启动共聚焦显微镜，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行扫描软件，选择timescan程序，设置扫描间隔时间（30s）、扫描次数（300次），开始扫描。

7.最后将数据输入统计软件进行整理、统计、分析。

（四）典型举例

见图1-32和图1-33。

图1-32　人脐静脉内皮细胞胞浆钙染色（×600）

图1-33　人脐静脉内皮细胞线粒体钙染色（×600）

参考文献

[1]Feng Z,Wei R,Chen X,et al.Grape seed extract enhances eNOS expression and NO production through regulating calcium-mediated AKT phosphorylation in H2O2-treated endothelium.Cell Biol Int,2010,34:1055-1061.

[2]Wu D,Chen X,Rui D,et al.Ischemia/reperfusion induce renal tubule apoptosis by inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and L-type Ca2+ channel opening.Am J Nephrol,2008,28:487-499.

[3]Haugland RP.The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed. Eugene,OR:Molecular Probes,2005:chapter 19.

[4]Paddock SW.Confocal Microscopy Methods and Protocols.New Jersey:Humana Press,1999:261-303.