细胞内染色及检测

（一）实验目的及原理

细胞内pH在不同生理和病理过程中起重要作用，包括细胞增殖、细胞凋亡、肌肉收缩、离子转运和内环境稳定、胞吞作用等。

BCECF可作为双激发比率pH探针使用，用比率测定方法可显著降低由于探针浓度、渗漏、光漂白的变化所造成的信号错误，pH6.4～7.4之间，BCECF的比例荧光与pH有很好的线性关系，其最大分辨率为0.4个pH单位。

（二）实验材料

BCECF；α-MEM；K+-MEM-HEPES；肾小管上皮细胞（HK-2）等。

（三）实验流程

1.培养HK-2细胞，使之状态良好，传代至petri皿，待细胞汇合度达70%～80%。

2.将储备的BCECF（浓度为2mmol/L）荧光探针用无血清、无氨基酸α-MEM配成终浓度为1～5μmol/L，加入细胞中，每孔100μl，37℃孵育20min。

3.K+-MEM-HEPES洗涤细胞2次，更换α-MEM（包含20mmol/LHEPES和2%血清），继续孵育10min。

4.K+-MEM-HEPES洗涤细胞2次，加入1ml，上镜观察。

5.启动共聚焦显微镜，打开共聚焦扫描软件，设置488nm激光，双通道530 nm和640nm同时接收，扫描图像。

6.设置TimeScan程序，间隔时间，扫描次数，打开“Series Analysis”窗口，记录intensity/time变化曲线，分析发射波长530nm/640nm的比值，确定pH的变化。

（四）典型举例

HK-2细胞内H+的检测，见图1-34。

图1-34　肾小管上皮细胞胞内H+染色荧光图像（×600）

A.发射波长530nm；B.发射波长640nm

参考文献

[1]Haugland RP.The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed.Eugene,OR:Molecular Probes,2005:chapter 20.

[2]Paddock SW.Confocal Microscopy Methods and Protocols.New Jersey:Humana Press,1999:305-313.