染色及检测

（一）实验目的及原理

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物体内一类活性含氧化合物的总称。主要包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等。静息条件下，细胞内ROS的水平被控制在很低的范围。ROS对信号转导通路中氧化还原敏感的蛋白激酶有调节作用。在疾病或某些外源性药物和毒物入侵后，ROS生成快速地增加，导致氧化应激和抗氧化防御间平衡失调，从而引起生物膜和大分子物质发生脂质过氧化损伤。ROS的产生和代谢失衡还与多种疾病有着密切的关系。

CM-H2DCFDA探针常用于检测细胞产生ROS的整体情况，从而反映细胞中呼吸爆发的状态。

（二）实验材料

CM-H2DCFDA探针，HUVEC，共聚焦专用petri皿，Hank’s液，PBS等。

（三）实验流程

1.培养HUVEC细胞，传代至共聚焦专用petri皿中，待细胞长至60%～70%为宜。

2.将储备的CM-H2DCFDA荧光探针（浓度为2mmol/L，-20℃保存）用Hank’s液稀释，终浓度5μmol/L。注：根据细胞种类不同，此终浓度可调：5～10μmol/L。

3.将细胞培养皿中的培养液吸出，PBS清洗2次，加入配好的终浓度探针100μl/皿，使探针稀释液完全覆盖皿中间玻璃小孔。

4.37℃孵箱孵育20min。

5.PBS清洗2次，加入Hank’s液，于37℃孵育10min，然后上镜观察。

6.启动共聚焦显微镜，选择488nm氩离子激光作为激发光，选择530±15nm通道作为接收通道。启动计算机，运行扫描软件，扫描图像。最后将图像在分析软件中进行处理。

（四）注意事项

1.本实验所用CM-H2DCFDA探针在强光照射下细胞绿色荧光增强，故操作时要控制激光强度，尽量减少实验误差。

图1-36　HUVEC细胞内总ROS检测（×600）

2.样品制备的过程应防止引入干扰因素，因为很多因素会导致细胞呼吸爆发，影响实际结果的真实性，比如应该尽量减少离心洗涤等操作，尽量保持细胞温度环境恒定，尤其是长时间监测。

（五）典型举例

见图1-36。

参考文献

[1]Feng Z,Wei R ,Chen X,et al.Grape seed extract enhances eNOS expression and NO production through regulating calcium-mediated AKT phosphorylation in H2O2-treated endothelium.Cell Biol Int,2010,34:1055-1061.

[2]Haugland RP.The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies ,10th ed.Eugene,OR:Molecular Probes,2005:chapter 18.