检测蛋白质相互关系

（一）实验目的及原理

荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用以及其他一些方面的研究中得到广泛应用。

FRET原理：当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态。光能可被生色团在10～15s内吸收而在10-9s内再发射出来。然而，也有可能被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级内发荧光，这后一种现象称为FRET。FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。当FRET发生时，供体的荧光减弱而受体的荧光增强。荧光素在激发态的寿命是10-9s，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。

FRET发生的基本条件是：①供体和受体的距离必须达到一定的数量级（20～100 Å）；②受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠；③供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。

（二）主要实验材料

以青色荧光蛋白（cyan fluorescence protein，CFP）/黄色荧光蛋白（yellow fluorescence protein，YFP）［CFP-/YFP-EBPα蛋白为增强子结合蛋白α（enhance binding proteinα）］为例。了解FRET对（以CFP/YFP为例）所标记蛋白的特性，见表1-12。

表1-12　FRET实验供体与受体荧光蛋白的选择

（三）实验流程（以OlympusFV1000激光共聚焦显微镜为例）

1.点击图像获取窗口中的荧光按钮，使其处于按下状态并自动打开荧光，在荧光显微镜下，寻找有荧光标记的细胞，并初步选择比较明亮的细胞置于视野中央。

2.扫描参数的调节

（1）点击使其处于弹起状态以关闭汞灯光闸编制受体漂白FRET实验流程。

（2）并从染料列表中选择相应的染料（如CFP和YFP），然后点击Apply按钮确认。

（3）点击Focuse x2或XY Repeat进行预扫描。

（4）调节两个通道的（如CFP和YFP）HV、Gain、Offset。

3.编制受体漂白FRET实验流程

（1）选择XYT扫描方式。

（2）在时间扫描中，扫描数量设定为5即可。

4.设定漂白

（1）选择漂白SIM按钮，跳出漂白界面，按指导操作。

（2）选中MAIN，选中ROI选择键，在图像上选择需要漂白的区域，选中用于受体漂白的激光器，如515nm等，并根据漂白情况选择漂白激光强度，输入需要漂白的时间或幅数，根据实际漂白效果，如果很快漂白则输入值低一些，如果漂白慢则输入值大一些；输入等待FRAM数，输入1Frame。

5.执行XYt扫描。

6.FRET图像的计算

（1）点击快捷键，打开受体漂白FRET计算窗口。

（2）将第5步获得的时间序列图像选入，并选择相应通道，点击New Image按钮，就会生成FRET计算后的图像。

（3）从获得的FRET计算结果中可以得出FRET在细胞内发生的位置和FRET对中供体和受体的距离值，见图1-42（引用参考文献2中的图）。

图1-42　利用FRET技术对GHFT1-5细胞中CFP和YFP/EBPα蛋白的共定位分析

A.供体CFP-EBPα图像；B.未发生FRET的EBPα蛋白图像；C.发生FRET的EBPα蛋白图像；D、E、F.所选择EBPα蛋白（图A～C）相对应的典型直方图（见参考文献2）

（四）注意事项

1.应用GFP产生FRET需满足几个条件：①两种荧光蛋白的激发光谱需分开，易于选择性激发；②供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的激发光谱有重叠；③两种荧光蛋白的发射光谱需分开，易于区分鉴定；④两个荧光发色基团之间的距离要小于100Å。条件很多，但是能完全符合以上条件的几乎找不到。

2.常用于FRET的荧光蛋白对　CFP-YFP；CFP-dsRED；BFP-GFP；GFP-dsRED；YFP-dsRED；Cy3-Cy5；Alexa488-Alexa555；Alexa488-Cy3；FITC-Rhodamine（TRITC）；YFP-TRITC；YFP-Cy3。

参考文献

[1]Verveer PJ,Wouters FS,Reynolds AR,et al.Quantitative imaging of lateral ErbB1 receptor signal propagation in the plasma membrane.Science,2000,290:1567-1670.

[2]Sekar RB,Periasamy A.Fluorescence resonance energy transfer（FRET）microscopy imaging of live cell protein localizations.J Cell Biol,2003,160:629-633.

[3]Elangovan MH,Wallrabe Y,Chen RN,et al.Characterization of one-and two-photon excitation fluorescence resonanceenergy transfer microscopy.Methods,2003,29:58–73.