肾脏细胞微分离技术

（一）实验目的

利用解剖显微镜微分离肾脏组织，保证纯度。培养观测不同肾脏细胞的形态功能。

（二）实验试剂

Ⅴ型胶原酶（13.6mg/ml），细胞培养用液：10%FBS、15%FBSDMEM含EGF（10ng/ml）、Insulin（10μg/ml）、Transferrin（5μg/ml）、KHB缓冲液。

（三）仪器

灌注泵、解剖显微镜。

（四）实验流程

1.灌注方法

（1）100～150gSD大鼠，乙醚麻醉，腹主动脉插管，全身肝素化。

（2）灌注生理盐水，清洗肾脏2min，直到肾脏变白为止。利用灌注泵用Ⅴ型胶原酶37℃水浴循环消化15min。

（3）观察到双侧肾脏变软，用生理盐水冲洗肾脏，迅速放置冰浴缓冲液中。

（4）用无菌刀片仔细剥离肾脏，移到10cm培养皿中，加入缓冲液。

2.分离肾组织

（1）在显微镜下观察各层组织，发现肾单位松散，肾小球及肾小管分离完整明显。利用解剖显微镜，根据肾脏解剖结构，分离肾脏组织，包括：肾小球、近曲肾小管、远曲肾小管、集合管、髓襻。

（2）利用特殊拉制的微细管，轻轻吸取分离好的各个游离的肾组织，分别放入做好标记的24孔板中。每孔100个肾组织（例如：100个完整的近曲肾小管）绝对保证纯度。

（3）培养：24孔板中，放置适合不同肾脏组织的培养液：系膜细胞培养液，上皮细胞培养液。倒置显微镜下观察纯度达100%，置于37℃5%CO2孵箱中，培养1周左右，即可见原代细胞生长并融合成片。

（4）1周后，镜下观察不同肾脏组织，细胞已贴壁生长。可传代细胞，利用微分离的培养细胞做细胞生物学相关实验。

（五）注意事项

1.大鼠动物手术操作相对复杂，如果不能结扎分支血管，很可能导致灌注消化不完全充分，造成肾脏组织分离不开。

2.实验操作过程相对要快些，时间过长容易导致组织细胞活性降低。

3.肾脏组织灌注消化时间尤为关键，消化时间短，组织分离不明显，很难分离。时间长，容易导致组织损伤过大，培养时细胞不易生长。

4.微分离时要防止肾小球、肾小管破碎折断，保障细胞绝对的纯度。

（六）典型示例

见图1-52。

图1-52　显微镜下显示分离出的肾小球，纯度100%（×40）

（七）KHB缓冲液配方

见表1-13。

表1-13　KHB缓冲液配方

注：无菌滤过，4℃保存

参考文献

[1]傅博，陈香美，李文歌，等.用微分离方法培养肾皮质近曲小管和髓质集合上皮细胞及其生物学特征的研究.解剖学杂志，1999,22:63-66.