亚细胞组分分离技术

（一）实验目的及原理

细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称作亚细胞组分。对于细胞的结构和功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其研究手段之一是分离纯化亚细胞组分，观察它们的结构、功能或进行生化分析。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心（图1-53）。

（二）实验试剂

1.实验储存液

（1）100mmol/LEDTA：3.36gEDTA溶于100ml去离子水，室温保存。

（2）100mmol/LPMSF：174mgPMSF溶于10ml异丙醇，如需要超声震动混匀，室温避光保存。

（3）PIPES缓冲液：配制4×和10×储存液，0.45μmol/L滤器过滤，4℃冰箱保存（表1-14）。

2.不同组分提取液

（1）皂苷提取液（0.015%，pH6.8,4℃保存）：加热搅拌溶解18.75mg皂苷于10ml4×储存液，然后加入1mlPMSF,联合加入15ml4×PIPES缓冲液和5mlEDTA，加入去离子水定容至100ml。

图1-53　细胞不同组分分离法

表1-14　PIPES缓冲液

（2）Triton X-100提取液（0.5%，pH7.4，4℃保存）：加入25ml4×PIPES缓冲液，1mlPMSF，3mlEDTA，5ml新配制的10%TritonX-100,定容至100ml。

（3）Tween/DOC提取液（1%Tween/0.5%DOC，pH7.4，4℃保存）：分别用2.5ml10×PIPES缓冲液，溶解0.5gDOC和1mlTween-40，将两者混合，加入1mlPMSF，定容至100ml。

（4）细胞骨架溶解缓冲液（CSK）（5%SDS，10mmol/L Na3PO4，pH7.4）。

①非还原性缓冲液：5ml20mmol/LNa3PO4缓冲液中溶解0.5gSDS，加入去离子水定容至10ml。

②变性缓冲液：在非还原性缓冲液中加入1mlβ-巯基乙醇，定容10ml。

（三）实验流程

1.细胞准备

（1）悬浮细胞

①离心：1300r，5min离心沉淀细胞，弃上清。

②洗涤：加入2ml预冷PBS，重悬细胞沉淀。

③离心：1300r，5min离心沉淀细胞，弃上清。

④提取：加入组分提取试剂，5倍体积于沉淀。

（2）贴壁细胞

①洗涤：加入2ml预冷PBS洗涤细胞。

②提取：以25cm×25cm细胞培养瓶为例，每瓶细胞加入组分提取试剂1ml。

2.组分提取

（1）细胞质组分（皂甙提取）

①细胞准备完毕，加入4℃预冷皂苷提取液。

②将混合物至于冰上于摇床孵育5～10min，台盼蓝排除实验确定95%～100%的细胞膜通透性发生改变。

③对于悬浮细胞，2170r离心5min，保留上清液，保存于-70℃冰箱，留取沉淀用于下一步实验。

④对于单层贴壁细胞，倾斜培养瓶，吸出胞质蛋白提取物，记录体积，保存于-70℃冰箱。

（2）细胞膜及细胞器组分（Triton X-100提取）

①对于悬浮细胞加入皂苷提取液等量的TritonX-100提取液，轻柔重悬沉淀，充分混匀。

②对于单层贴壁细胞，加入1mlTritonX-100提取液。

③将混合物至于冰上于摇床轻柔震动孵育30min。

④对于悬浮细胞，6816r离心10min，保留上清液，保存于-70℃冰箱，留取沉淀用于下一步实验。

⑤对于单层贴壁细胞，倾斜培养瓶，吸出胞膜及细胞器蛋白提取物，记录体积，保存于-70℃冰箱。

（3）细胞核组分（Tween/DOC提取）

①对于悬浮细胞加入Triton X-100的1/2容量的Tween/DOC提取液，轻柔重悬沉淀，充分混匀。

②8002r离心5min，保留上清液，保存于-70℃冰箱，留取沉淀用于先一步实验。

③对于单层贴壁细胞，加入0.5～1mlTween/DOC提取液。

④对于单层贴壁细胞，倾斜培养瓶，吸出胞膜及细胞器蛋白提取物，记录体积，保存于-70℃冰箱。

（4）细胞骨架及核基质组分

①将不溶于上述提取液的剩余细胞碎片，用1.2mmol/L的PMSF（pH7.4的PBS配制）充分混匀洗涤。

②10629r离心10min，机械剪切DNA。

③悬浮细胞剩余沉淀用-20℃预冷的90%丙酮充分洗涤，低温离心，上清保存于70℃冰箱。

④单层贴壁细胞用PBS原位冲洗，不溶于提取液的的组分用不含β-巯基乙醇的CSK溶液重悬，保存于-70℃冰箱。

参考文献

[1]Ramsby and Makowski.Differential Detergent Fractionation of Eukaryotic Cells.The Proteomics Protocols Handbook.2005,37-48.