的提取与纯化

（一）实验目的与主要原理

DNA存在于细胞核中。通过裂解组织和细胞，使细胞膜破碎，暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去除蛋白质，从而获取高纯度DNA。

（二）实验材料

蛋白酶K（20mg/mL），裂解液（100mmol/LTris（pH8.0），500mmol/LEDTA（pH8.0），20mmol/LNaCl，10%SDS），硅胶柱，TE（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.5×TAE（20mmol/LTris-乙酸，0.5mmol/LEDTA，pH8.0），10×Loadingbuffer（50mmol/LEDTA，60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH7.0）。

（三）实验方法

DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚∶氯仿抽提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚∶氯仿抽提法由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大，目前使用者较少。而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较为多见，主要步骤如下。

1.样本前处理

哺乳动物细胞：提前准备55℃水浴。

（1）对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。

（2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白酶K终浓度达到500μg/ml，37℃孵育4～6h。

动物组织：提前准备55℃，70℃水浴。

（1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。

（2）加入150～200μl的裂解液（含500μg/ml的蛋白酶K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6～8h，可以过夜裂解，每小时颠倒2～3次）。

（3）如果需要去除RNA，可以加入适量RNase A于样品中，室温孵育2min。

（4）12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管中。

2.DNA提取过程

（1）利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠沉淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去）。

（2）将上述的混合物加入到硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%的乙醇清洗杂质，洗2～3次。

（3）将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200μl预热TE（60℃），或去离子水（pH>7.0）室温静置1min，12000r离心1min，洗脱DNA。

（4）为得到更多的DNA，进行第二次洗脱，在柱的中央加入200μl预热TE（60℃），或去离子水（pH>7.0），室温静置1min，12000r离心1min，洗脱DNA。洗脱出的DNA于-20℃保存。

3.琼脂糖电泳

（1）1%琼脂糖凝胶的配制：例如：0.15g琼脂糖+15ml0.5×TAE微波炉加热至沸腾，待降低至70℃加入Gold view染料（5μl/100ml），倒入小型胶槽中（其他规格胶槽按此比例配制）。室温静置40min。

（2）取50～100ngDNA，用去离子水补充体积至10μl，加入1μl10×DNAloading Buffer，进行电泳。电泳120V20～30min（电泳液为0.5×TAE）。

（四）注意事项

1.裂解液与样品的比例要适当，过少的裂解液可能导致样本裂解不完全，而过多的裂解液也可能会影响提取效果。

2.尽量切碎组织，以免影响裂解效果；完全裂解后可以呈黏稠状。

3.组织样本一般要保存在-80℃冰箱或液氮中，且避免反复冻融；使用无菌离心管和枪头，避免DNA酶污染。

（五）主要问题及解决方法

1.为什么在琼脂糖电泳时，提取的DNA有许多片段？

答：这主要是因为DNA发生了酶解或断裂。主要原因包括：组织不新鲜，或者保存过程中发生了冻融，离心管或枪头有DNA酶的污染。解决方案：保证组织的新鲜和避免反复冻融，避免DNA酶污染。

图2-1　人白细胞基因组DNA

M.1kbmarker；1～8.从不同人白细胞中提取的基因组DNA

2.为什么提取的DNA量很少？

答：这主要是因为裂解不完全，可能是组织裂解液用量不够或蛋白酶K的浓度不够或活性下降。解决方案：要使用足够量的裂解液，要使用活性很高的蛋白酶K。

（六）结果示例

这是我室从人白细胞中提取的基因组DNA，从图2-1上可以看出，基因组DNA片段完整，无明显的降解。