实时荧光定量技术

（一）实验目的与主要原理

实时荧光定量PCR技术是通过对PCR反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析的技术。目前的方法包括SYBR GREENⅠ染料法、Taqman探针法以及Beacon探针法。其中，SYBR GREENⅠ染料法价格低廉，操作简单，但是灵敏度和准确度较低，而Taqman探针法和Beacon探针法灵敏度和准确度较高，但是需要合成特异性的荧光探针，价格比较昂贵。这里重点介绍SYBR GREENⅠ染料法和Taqman探针法。

（二）实验材料

SYBR GREENⅠ染料，Taq酶，Taqman探针等。

（三）实验步骤

1.配制扩增混合物，表2-3。

表2-3　扩增混合物的配制

2.PCR循环

如果采用SYBR GREENⅠ染料法，可以使用以下程序（三步法）：

如果采用Taqman探针法，可以使用以下程序（两步法）：

3.数据分析　定量PCR主要作用是对模板进行精确定量，目前常用的方法有两种，一种是绝对定量，一种是相对定量。实验者可以根据自己的实际需要进行选择。绝对定量是利用标准品（如已知绝对浓度的DNA或RT产物）的阈值循环（threshold cycle,CT）值绘制标准曲线，然后利用标准曲线，换算样本的实际浓度。相对定量是指两组之间的互相进行比较，其结果是一个比率。利用这两种方法，可以对不同组别之间基因表达水平进行比较。另外还需要对模板进行内参基因表达水平的检测，以便对结果进行标准化。

（四）注意事项

1.如果采用SYBR GREENⅠ染料法，需要注意以下事项：最好选用热启动Taq酶；PCR产物不能有其他非特异性扩增和引物二聚体（需要优化PCR条件）；PCR产物长度为75～300bp。

2.如果采用Taqman探针法，需要注意以下事项：需选用有5’～3’外切酶活性高的Taq酶；探针设计要符合Taqman探针要求（一般要使用专业的软件或由专业公司设计，最好选用文献报道的探针）；要优化PCR反应条件，减少非特异性扩增；建议使用专门用于Taqman探针法的Taq酶及配套试剂盒。

（五）主要问题及解决方法

1.为什么采用SYBR GREENⅠ染料法时，在荧光实时检测图上没有上升的曲线或者是35个循环后才出现？

答：发生这种情况的原因主要是PCR扩增效率低，导致PCR产物过少造成的。此时要对PCR条件进行优化，提高PCR反应效率，扩增出足量的特异性产物。

2.为什么采用Taqman探针法时，在荧光实时检测图上没有上升的曲线？

答：当出现这种情况时，首先应该进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否扩增出PCR产物，如果没有PCR产物，则需要进行PCR条件的优化，扩增出特异性的产物；如果有特异性的PCR产物扩增，则需要考虑是否探针存在问题，如探针是否存在发卡结构，Tm值是否合适，与引物之间是否形成二聚体等；此外Taq酶的5’～3’外切酶活性对于Taqman探针法也非常重要，建议使用专门用于Taqman探针法的Taq酶及配套的试剂盒。

（六）结果示例

利用Taqman定量PCR检测GAPDHmRNA表达水平（图2-6）。

图2-6　Taqman定量PCR检测冰冻切片和石蜡切片RNA水平

A.定量PCR荧光曲线图；B.利用CT值绘制的标准曲线（102～106拷贝）