酶切反应与片段纯化

（一）实验目的与主要原理

为了进行基因克隆，必须要对目的片段和载体进行酶切，从而使两者形成粘性末端或平端，这样方可进行后续的实验。酶切主要使用的酶是内切酶。不同的内切酶识别不同的碱基序列，可以根据实际需要，将目的片段或载体切割成不同长度和末端的DNA片段。这些片段经过纯化，即可进行下一步的连接实验。

（二）实验材料

限制性内切酶，琼脂糖，硅胶柱等。

（三）实验步骤

1.酶切反应　按照以下程序进行酶切（如质粒量增加，则酶量增加，且总体系比例相应增加），见表2-7。

表2-7　酶切程序

37℃，4h或过夜

2.DNA片段纯化　将酶切产物进行琼脂糖电泳，根据实际需要切取DNA片段，后按照以下程序进行纯化：

（1）切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如凝胶重为100mg，可视为100μl，依此类推。

（2）加入3倍体积溶胶液（一般在试剂盒中提供），于55℃水浴融胶6～10min，间断（2～3min）混合，确保胶块完全融化。

（3）将融化的凝胶溶液降至室温（高温时吸附柱结合DNA能力弱），加入吸附柱中，静置1min，10000r离心1min，弃流出液。

（4）加入650μl洗液（一般在试剂盒中提供，注意要加乙醇），10000r离心1min，弃流出液。

（5）重复第4步。

（6）将吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入30～50μlTE或去离子水（pH＞7.0）（如果DNA片段＞5kb，建议将TE或去离子水在70℃水浴预热，以增加溶解度），室温静置1min。

（7）10000r离心1min，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。

（四）注意事项

1.紫外照射对DNA会造成损伤，影响克隆，连接等实验，因此，要尽量缩短紫外照射时间。

2.尽量将胶块切小，以促进凝胶的融化。

（五）主要问题与解决方法

1.为什么酶切产物电泳后发现片段长度与预计的长度不符？

答：首先要确定所使用的内切酶是否正确，然后要考虑是否发生了“星号”反应。“星号”反应是由于使用了过量的酶或反应条件不合适，导致的非特异性切割。解决方法：仔细研究质粒上的酶切位点，避免发生错判；在进行酶解反应时，控制好酶的使用量和反应条件，尤其注意“星号”活性比较强的内切酶。

2.为什么将纯化后的产物进行电泳，发现没有条带或者条带很弱？

答：这主要是由于回收效率低造成的，可以依照以下顺序进行分析：①确定凝胶完全溶解于溶胶液中；②洗液是否加入了乙醇；③溶解DNA的TE或去离子水温度太低。解决方法：要确保凝胶完全溶解于溶胶液中，必要时增加溶胶液的量和溶解时间，确定洗液中加入了乙醇，如果DNA片段＞5kb，要用70℃的TE或在去离子水溶解。