（一）实验目的与主要原理
目前常用的质粒提取的方法是碱裂解法。这是根据质粒DNA与基因组DNA在碱性环境的不同状态所设计的方法。在碱性环境中，细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，而闭环的质粒DNA双链仍会保持固有结构，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成复合物，被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中沉淀出来，而质粒DNA仍留在上清液中，最后通过硅胶柱将质粒DNA提纯，用于后续实验。
（二）实验材料
1.悬浮液 50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。
2.裂解液 0.2NNaOH，1%SDS，临时配制。
3.中和液 5mol/L醋酸钾300ml，冰醋酸57.5ml，加去离子水至500ml。
4.硅胶柱，洗液（注意成分为70%乙醇），TE或者去离子水。
（三）实验步骤
1.已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液（3～5ml），37℃恒温箱中摇菌过夜。
2.将细菌装在2ml的EP管中，12000r，1min，弃上清。
3.加入100μl悬浮液，充分混匀。
4.加入200μl裂解液，轻柔地颠倒混匀，避免质粒断裂，室温放置5min（观察溶液变为透明黏稠状）。
5.加入150μl中和液，颠倒混匀（会产生蓬松的白色沉淀物，包括基因组DNA，蛋白，SDS，细胞碎屑）。12000r，离心10min，将上清倒至硅胶吸附柱中，吸附柱下面放置一个装废液的管。
6.12000r，1min，弃残液。
7.加入500μl的洗液，12000r，1min，弃残液。
8.重复第7步。
9.将硅胶柱室温放置5～10min，使乙醇完全蒸发。
10.换无菌EP管，加入100μl的TE和去离子水（事先可在60～70℃水浴）。
11.12000r，1min，将下层液体收集，取部分液体琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒浓度。
（四）注意事项
1.培养的细菌量不宜过多，太多则会影响细菌的裂解和质粒的提取。
2.当温度低于20℃时，一些试剂可能发生沉淀，因此需要加热，使沉淀完全溶解时，才可使用。
（五）主要问题与解决方法
为什么提不出质粒？
答：这可能与以下情况有关：①细菌中是否含有质粒；②细菌是否完全裂解；③洗液是否添加了乙醇。解决方法：可以通过测序或者菌液PCR的方法确定细菌是否含有质粒，在加入裂解液时，一定要充分混匀直到细菌完全裂解，在加洗液前，确定其已经加入了乙醇。
（六）结果示例
结果显示了我室进行的对人高亲和力钠二羧酸转运蛋白（SDCT2）全长cDNA基因的克隆（图2-10和2-11）。
图2-10 人SDCT2基因克隆及真核表达载体pcDNA-SDCT2构建
图2-11 人SDCT2基因的克隆
A.利用人EST数据库检索与序列拼接方法，推断出人SDCT2的cDNA序列，用Primer5.0软件设计PCR引物，上游引物：5’-cgc cag gcg atc gcg ctg atg-3’，下游引物：5-gaa tga ata aat gga aga agg agt g-3’，提取正常人肾组织RNA，利用RT-PCR扩增出人SDCT2基因（M.DNAmarker；1.SDCT2基因的RT-PCR产物）；B.人SDCT2基因克隆入pGEM质粒，后亚克隆入真核表达载体pcDNA，M.DNA Marker；1.pGEM-SDCT2/BamH I+Xho I双酶切结果；2.pcDNA 3.1/BamH I+Xho I双酶切结果；3.pcDNA-SDCT2/BamH I+XhoI双酶切结果；C.人SDCT2基因测序结果，SDCT2含有一个长1809 bp的开放阅读框（ORF），可编码602个氨基酸，将所克隆的人SDCT2 cDNA基因递送到GenBank中进行了注册登记，（GenBank的收录号码为AY072810）
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