用芯片技术进行表达谱分析

在上千个miRNA中，哪些miRNA在特定的生物学功能和疾病发生中起着关键的作用呢？这是研究miRNA功能所面临的首要问题。miRNA基因芯片技术可以快速有效的提供miRNA表达图谱变化。通过比较正常样本与疾病样本中miRNA表达谱的差异，寻找在生物学功能上起作用的miRNA。这种高通量的miRNA表达谱分析为临床疾病的诊断提供了新的思路，也为miRNA作为疾病的标志物提供了依据。然而基因芯片技术的结果是半定量的，且重复性较差，这就需要通过其他的实验方法来进一步验证。

（一）MicroRNA芯片技术的基本原理

MicroRNA芯片采用大规模微阵列技术，一张芯片上包含成千上万个探针，大大提高了筛选的速度和通量。一些公司的MicroRNA芯片采用微流体μParaflo®芯片技术，再结合光敏酸化学技术和数字光控技术，保证了芯片体系的灵活性、高保真性（最长合成碱基可以到100bp）以及杂交体系的稳定性。微流体芯片是由数以千计的三维小室组成的闭合系统，隔绝了与空气接触的机会，不存在荧光染料的氧化和衰退问题；微流体技术还使得阵列上的样品溶液分布均一，同时促进了杂交反应，提高了洗脱过程的严谨性，因此可以对芯片实时监控扫描，针对每次非特异性杂交的洗脱过程进行实时监控，确保最后特异性杂交信号值的采集。同时，它引入了光敏酸（PGA）去保护法来进行探针分子常规单体的合成，而这一点在进行miRNA芯片合成时显现得尤为重要，由于成熟miRNA很短小，因此在进行探针原位合成时，需要进行碱基的修饰来提高杂交探针的检测灵敏度、特异性、均一化。值得一提的是，芯片的探针经过特别合成，Tm值均一，提高了杂交的检测性和特异性。检测探针由目的序列的互补碱基和一个非核苷酸分子的伸展臂组成，伸展臂减少了空间位阻影响，提高了探针和目的片段的结合能力。由于采用了微流体技术，miRNA芯片除了实时更新外，还可以灵活定制，比如目前很多新发现的miRNA都可以加入它的芯片平台，进行表达谱分析实验。

（二）主要实验材料

生物芯片分析仪，生物芯片扫描仪，miR标记kit。

（三）实验方法

1.RNA的提取（见核酸的提取与纯化）。

这是我室从人肾中提取的总RNA，从图2-12可以看出RNA无明显的降解。

图2-12　总RNA电泳图（取3μlRNA样品）

表2-9　配制反应液

2.小分子RNA的分离：用离心膜柱进一步从总RNA中分离出小分子RNA。

3.MicroRNA的荧光素标记

（1）除酶之外的所有试剂置于冰上溶解一分钟，振荡混匀后轻微离心。

（2）按表2-9配制反应液，充分混匀。

（3）37℃孵育30min。

（4）将反应液放入95℃终止酶反应，RNA变性后立即将反应管置于冰上，放置2～5min，轻微离心。

（5）按表2-10配方，向CIP反应液反应管中添加标记试剂，充分混匀。

（6）16℃孵育1h。

（7）65℃孵育15min以终止标记反应，轻微离心后标记产物放置于4℃以备后续杂交反应使用。

表2-10　配制反应液

4.MicroRNA芯片杂交：将标记的MicroRNA加入100μl含有25%甲酰胺的6×SSPE杂交液（0.9mmol/LNaCl，60mMNa2HPO4，6mmol/LEDTA，pH6.8）中，在34℃与芯片进行杂交，然后用激光扫描仪进行扫描。

5.数据分析：用每个探针的原始信号值减去该点的前景值得到每个探针的修正值。采用Lowess方法或线性归一化进行片内归一化。如果log2（实验组/对照组）为阳性表示MicroRNA表达上调；如果log2（实验组/对照组）为阴性表示MicroRNA表达下调。

（四）实验结果实例

这是我们用MicroRNA芯片杂交技术比较24月衰老大鼠肾组织与3月年轻大鼠肾组织的MicroRNA表达谱差异结果（图2-13）。

图2-13　3月龄大鼠肾组织（红色）与24月龄大鼠肾组织（绿色）的MicroRNA芯片杂交结果