表达水平的检测方法

为了进一步验证miRNA在组织细胞内的表达水平，目前常用来检测miRNA表达的技术主要有以下几种：Northern blot杂交；原位杂交；Real-Time定量PCR（qPCR）。其中，Real-Time定量PCR主要有2种方法：poly（A）聚合酶加尾法Real-Time定量PCR和Stem-loop Real-Time定量PCR。Real-Time qPCR法采用的信号检测模式主要有两种：荧光染料渗入法和TaqMan探针法。前者成本低，但特异性差；后者特异性好，但每种miRNA都需要设计一个对应的TaqMan探针，成本相对较高。这几种技术各有利弊，可以相互结合应用，来反映细胞内miRNA的真实表达水平。

（一）poly（A）聚合酶加尾法Real-Time定量PCR

1.poly（A）聚合酶加尾法Real-Time定量PCR的基本原理　目前miRNA的检测方法主要有Northern Blot等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。用Real-Time定量PCR技术对miRNA进行检测，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。poly（A）聚合酶加尾法Real-Time定量PCR是先用poly（A）聚合酶（PAP）处理总RNA，使miRNA的3'端加上一段poly（A）尾巴，然后用5'端含有接头序列的poly（T）引物进行反转录，使第一链cDNA加上一段接头，为随后的PCR扩增提供反向通用引物序列，再利用一条与miRNA序列特异的正向引物就可实现PCR扩增。以下用miRNA qPCR Detection Kit对miRNA进行检测（图2-14）。

图2-14　poly（A）聚合酶加尾法实时定量PCR检测miRNA的原理

2.实验材料

（1）主要实验仪器：冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统、Real Time PCR Detection System。

（2）主要实验试剂：Trizol、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、miRNA qPCR Detection Kit。

3.实验方法

（1）RNA的提取（见核酸的提取与纯化）。

（2）miRNA3’端进行加“Poly A”处理

1）融解加“PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

2）PolyA Reaction反应液的配制

在冰上的预冷无RNase的反应管内加入以下试剂至总体积20μl。

在反应中使用的总RNA必须含有小分子RNA。

总RNA使用量可在100ng至10μg调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng至1μg之间调整。

表2-11　PolyA反应液配制

（3）PolyA反应：混匀配制的反应混合液，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。

（4）Poly A化的RNA进行反转录反应

1）融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

2）RNA-Primermix的配制反应：在冰上预冷的无RNase的反应管内加入以下试剂至总体积13μl（表2-12）。

表2-12　RNA-引物混合液的配制反应

3）混匀RNA-引物混合液，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。

4）配制反转录反应液：在RNA-引物混合液反应管内加入以下试剂至总体积25μl（表2-13）。

5）反转录反应：混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min，再进行85℃5min灭活处理。所得的单链cDNA放置于-20℃保存。

表2-13　配制反转录反应液

（5）qPCR检测miRNA

1）miRNA检测引物设计：因为miRNA序列长度一般都在18～24bp，所以其检测的正向检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA3’端去除几个碱基后整理的序列。逆向引物则可选择通用引物即可。

2）miRNA qPCR 正向引物设计举例（以小鼠mmu-miR-125b-5p为例）：

在miRNA Database中查找检测的miRNA序列，如图2-15所示：

miRNA Database：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL

则其正向检测引物可为：

miRNA序列　　　ucccugagacccuaacuuguga

Primer序列　　　tccctgagaccctaacttgtga（Tm：58.8）

图2-15　在miRNADatabase中查找检测的miRNA序列

3）融解2×qPCRmix（如有必要，融解50×ROXReference Dye）上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）（表2-14）。

表2-14　定量PCR反应液配制

4）2×qPCRmix设定为总反应体积的一半，其他组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。

5）Rox Reference Dye使用在需要用Rox校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。

6）引物终浓度可在0.2～0.4μmol/L范围内调整，一般条件下0.2μmol/L的量即可达到理想的效果。

7）第1链cDNA通常需要稀释后再使用，防止反转录体系对qPCR体系的影响。

8）充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。

9）qPCR反应，使用标准的三步法进行检测（表2-15）。

对于用SYBR Green染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（表2-16）。

表2-15　定量PCR反应条件

表2-16　定量PCR融解曲线分析

4.实验注意事项

（1）2×定量PCR反应液中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃10min能充分的激活酶活性。

（2）因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。

（3）进行反转录的Oligo dT接头其长度为53bp，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22bp左右），所以延伸只需10sec即可。对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79～83℃，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。如使用的为不同公司的定量PCR仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件。

5.实验结果实例　以下是用miRNA qPCR Detection Kit检测人组织中miRNA的表达水平。

所选的miRNA及其扩增长度信息如表2-17（图2-16）。

（二）Stem-loop实时定量PCR

1.Stem-loop实时定量PCR的基本原理　传统实时定量PCR只能检测到miRNA前体，而Stem-loop实时定量PCR技术可以解决这一问题。Stem-loop实时定量PCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环（stem-loop）结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR二个关键步骤。该技术具有以下优点：高度特异性，对序列高度同源的miRNA也可精确区分，能检测只有一个碱基差别的不同miRNA的表达水平；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度；样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA；适用范围广，总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测。

MicroRNA的RT-PCR一般使用茎环结构的引物，这种具有茎环结构的引物针对所需检测的目的microRNA设计，具有特异的序列。内参使用的是小RNAU6，U6的反转录使用的是随机引物。将反转录的产物作为real-timePCR的模板，检测目的microRNA的引物是针对目的microRNA的特异的上下游引物，检测内参使用的是针对U6的特异的上下游引物（图2-17）。

表2-17　人组织中miRNA的基本信息

图2-16　20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果

图2-17　Stem-loop实时定量PCR检测miRNA的原理图

2.实验过程

（1）用Trizol抽提总RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用异丙醇处理时需要4℃过夜。将抽提得到的RNA置于-80℃保存。

（2）将抽提的RNA进行反转录。反转录的体系一般使用12.5μl的体系。

具体的体系如下：

无RNase水

总RNA：0.625μg

反应缓冲液：2.5μl

dNTPs：2.5μl

RNase抑制剂：0.625μl

氯化镁：1.5μl

Primer：0.5μl

逆转录酶：0.625μl

具体的操作是事先计算好需要的模板量，以及所要的无RNase水的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及量，并将剩下的模板立即置于-80℃保存。再按照反转录的体系做好总的MIX，再分装到每个PCR小管内。

（3）将PCR小管置于PCR仪上反转，反转的具体程序如下：25℃5min，42℃60min，70℃15min。4℃储藏。

（4）反转录的cDNA作为实时PCR检测的模板，由于实时PCR检测灵敏性，要求每个样需要3个重复。

每一个反应的用量如下：

SYBR　　　　　　　5.0μl

引物混合物　　　　0.2μl

cDNA　　　　　　　1.0μl

水　　　　　　　　3.8μl

（5）在八连管中先加入模板，加入3.4μl的cDNA模板。

（6）根据需要检测样本的个数，计算所需要的SYBR、引物混合物、水量，具体的计算过程为：试剂单反应量X检测样本个数X3.4，根据计算需要的量制作混合液。将混合液加入每个八连管的小管中。

（7）将对应的每个八连管的小管取出10μl加入96孔板，每个小管对应96孔板的3个孔，即3个重复孔。

（8）加完样品后，用专用的封膜覆盖96孔板，用专用的刮板覆盖严实。

（9）上机检测。具体PCR程序如下：

50℃2min；

95℃5min；

95℃30s；

60℃40s；

72℃30s；

95℃15s；60℃30s；95℃15s。

3.实验注意事项

（1）由于实时PCR的检测十分灵敏，因此它对RNA定量的准确性要求较高，一般RNA的定量多采用3复孔定量。

（2）无论在反转录或实时PCR加样时要求加样一定要准确。

（3）在将八连管的mix加入96孔板前一定要充分混匀，一般采取的策略是将八连管一剪为二，置于上振荡混匀，振荡的转速不要太高，以免将管内的液体溅到盖子内。

（三）Northern blot杂交

MicroRNA是一类很小的分子，部分microRNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究有一定困难，特别是重复性较差，步骤繁琐等。目前多数研究人员采用Northern Blot，它是一种重复性好、灵敏高、直接的方法，可以用来检测microRNA的存在、表达量的变化等。而由于放射污染等原因，同位素标记的探针的使用有一定的局限性。

1.基本原理　将待检测的RNA分子变性后，通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，继而按其在凝胶中的位置转移到尼龙膜上，固定后再与同位素、地高辛或其他标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。Northern Blot可用于检测样品中的RNA及其含量，了解基因的状态，如是否有点突变、扩增重排等。

2.实验过程

（1）提前配制无过硫酸铵和TEMED的15%的尿素-PAGE胶的混合液，即

50ml预制胶：

尿素：24g

40%丙烯酰胺：18.75ml

5xTBE缓冲液：10ml

双蒸水：0ml

（2）器皿的清洗：器皿同Western Blot装置。

用清水冲洗干净，乙醇擦干3%；

H2O2填充浸泡电泳槽、玻璃片、梳子10min；

用0.1%DEPC处理过的水冲洗电泳槽，梳子和玻璃片。

用无RNAase擦海绵和其他相关器材。

（3）安装配胶装置。

（4）配胶：取10ml预制剂，加入33.3～45μl的过硫酸铵和10～20μl的TEMED，混匀，加入玻片中，加入10或15齿梳子。30～60min即可凝好。

（5）RNA样品的准备：小RNAs（大约107细胞）（或者总RNA20～200μg）在18μlDEPC水加入2μl10xRNA上样缓冲液。95℃加热5min，冰上冷却。瞬时离心收集RNA样品。

（6）电泳：（装置同Western Blot电泳装置），电泳液1xTBE。

15%尿素-PAGE在电泳液1xTBE进行电泳。电压180V直到溴芬兰到达胶的底部。在上样之前，300V预电泳10min（防止胶漏同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。其中溴芬兰的对应的分子量为13bp左右，二甲苯青FF对应的为40bp左右。

（7）转膜（装置同Western Blot转膜装置），转膜液为0.5xTBE。

1）将胶浸泡在0.5xTBE大约10min。

2）用溴乙锭（0.5μg/ml）染胶10min后，用紫外凝胶观测RNA电泳情况。用0.5xTBE洗胶5min。

3）用铅笔标记好转膜的面，将尼龙膜和两片厚滤纸浸泡在0.5xTBE大约10min。

4）制备凝胶、膜夹层。将滤纸、胶、膜、滤纸形成三明治结构，注意胶应该靠近阴极侧。注意每层间不能有气泡。

5）装配好转膜装置，装置同Western Blot转膜装置。

6）于冰上300mA转膜1h。

7）把膜（RNA面朝上）放在紫外交联仪中使用4000JUV进行交联。

8）将膜夹在厚的滤纸中间，80℃烘烤0.5～2h，可以轻压，以防止膜发生翻卷。

9）如果可以直接做，则放在室温即可；也可以储存在4℃，直到使用（可储存6个月）。

10）亚甲蓝（methylene blue）染色3～5min，在可见光下黄色滤光片对膜照相。

（8）杂交

1）在杂交炉中37～42℃的杂交液（7%SDS，0.2mNa2HPO4）中预杂交1h，然后将膜放入杂交袋，然后加入配好浓度的地高辛标记探针，在杂交炉中37～42℃杂交过夜。

2）地高辛标记探针使用浓度：将10μl的25μM的公司原液稀释10倍后分装储存，取储存探针液（2.5μmol/L）20μl/6ml（U6内参）或2.7～27μl储存液/10ml杂交液（根据miRNA的量或丰度定）。

3）37～42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜3次，每次15min。

4）室温MABT（0.1mmol/L马来酸，0.15mNaCl，0.3%Tween-20，pH7.5）洗膜3次，每次5min。

5）室温用封闭液（用MAB10倍稀释10×封闭液）封闭1h。

6）室温加入抗地高辛抗体40min（1∶10000～1∶5000封闭液）。注意：抗体用之前，应该以12000r速度离心5min。

7）用MABT液洗膜2次，每次15min。

8）膜在检测液（0.1mTris-HCl，0.1mNaCl，pH9.5）中平衡5min。

9）配化学发光液（1∶100），有RNA的膜面向上放入杂交袋中，加入1ml配好的化学发光液，挤出气泡，封口，孵育5min。

10）挤出化学发光液，封口，37℃孵育5～15min。

11）曝光2min至1h（根据情况定）。一般内参U6在5min内即可显影。

3.实验注意事项

（1）配胶时，由于浓度较大，所以尿素比较难溶，尿素的溶解不能加热，可以采用振荡或颠倒离心管；配好的无过硫酸铵和TEMED的15%的尿素-PAGE胶可以储存在室温或4℃冰箱中（可储存1个月左右）。

（2）电泳前，应该按照步骤将装置尽量进行无RNAase处理。

（3）RNA上样前，300V预电泳10min（防止胶漏，同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。此操作需要一定的训练，因为加样孔中很快会析出尿素，一旦有尿素析出对RNA电泳的形态会有一定的影响。

（4）LNA探针使用前进行分装，然后冻存于-70℃冰箱中。

（5）不同miRNA杂交的温度和时间不同，需要进行条件的摸索。一般内参温度为42℃。

（6）尼龙膜紫外交联和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

（四）原位杂交

原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测miRNA表达，可更直观地展示出miRNA的时空表达模式。它不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平。它是分析miRNA表达组织和时序特异性的有力工具。

1.实验仪器　恒温箱，正立荧光显微镜，摇床。

2.实验试剂　Let-7探针；3′-末端标记试剂盒、抗地高辛抗体、NBT/BCIP；蛋白酶K；甘氨酸、绵羊血清、牛血清白蛋白、三乙醇胺、甲酰胺、乙酸酐和Tween-20为常规试剂。

3.实验方法

（1）地高辛标记杂交探针

1）用末端转移酶将LNA（Locked Nucleic Acid，铆定核酸）修饰的探针的3′-末端标记上地高辛－ddUTP并将其配置成1μM。后放置在-20℃保存。

2）标记反应体系如下（表2－18）。

表2-18　地高辛标记探针反应体系

3）混匀后离心37℃孵育15min后放置在冰上。

4）加入2μl0.2mEDTA（pH8.0）终止反应。

5）用G25层析柱纯化探针。

（2）分子杂交

1）二甲苯脱石蜡10min×2次，然后用梯度乙醇脱水（100%，95%，80%，75%，每次5min），然后用双蒸水洗两次。

2）将组织载玻片浸入0.2N的HCl内5min，PBS洗涤，40g/ml蛋白酶K25℃消化20min，0.2%甘氨酸/PBS洗涤，PBS洗涤两次，用4%的多聚甲醛室温固定10min。

3）PBS洗涤5min×2次，常温条件下用乙酸酐／三乙醇胺（6.25μl乙酸酐，5.2μlof12NHCland14μl三乙醇胺/1mlddH2O）处理10min，PBS洗涤5min×4次，5×SSC洗涤5min×2次。

4）每张切片加预杂交液（60%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20，9.2mmol/L枸橼酸，50g/ml肝素，500g/ml酵母tRNA，pH6.0）20μl，恒温箱49.5℃放置2h。

5）吸取多余液体，加杂交液（2μl的探针放入100μl预热的杂交缓冲液），将盖玻片盖于切片上，恒温箱49.5℃过夜。

（3）杂交信号的检测

1）杂交后揭掉盖玻片，5×SSC洗涤切片5min×2次，50℃条件下50%甲酰胺/2×SSC洗涤20min×3次。

2）TBST（0.1mmol/LTrispH7.5，0.15mmol/LNaCl，0.1%Tween-20）洗涤切片5min×5次后，滴加封闭液（2%羊血清，2mg/ml牛血清白蛋白/TBST）封闭1h。

3）甩去多余液体，滴加抗地高辛抗体（用封闭液稀释1∶1000），4℃放置16h。

4）用TBST洗涤切片10min×4次，染色液（100mmol/LTris-HClpH9.5，50mmol/LmgCl2，100mmol/LNaCl，0.1%Tween-20）洗涤10min×2次，然后将新鲜配制的颜色反应缓冲液氮蓝四唑／5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（NBT/BCIP）（1ml染色液，2.4μlof100mg/mlNBT，3.5μlof50mg/mlBCIP，1mMlevamisole）滴在玻片上，孵育4～48h，注意避光和防止干燥。

5）将切片放入终止缓冲液（1×TEpH8.0）中终止反应后，显微镜观察细胞着色情况，拍摄照片。