冰冻组织切片免疫荧光双重染色可在一张组织切片上确定两种或多种抗原的存在和分布情况。
（一）实验步骤
1.冰冻切片4μm厚。
2.室温放置30min。
3.4℃丙酮固定10min。
4.加FITC标记的待测抗原的抗体。
5.放入湿盒中，室温孵育40min。
6.入PBS洗2～3min。
7.加TRITC标记另一种待测抗原的抗体。
8.放入湿盒中，室温孵育40min。
9.入PBS洗2～3min。
10.室温凉干，甘油封片（图3-16）。
图3-16 IgG（红色）+IgA（绿色）（×400）
（二）注意事项
1.冰冻切片最好用新鲜组织，切片完成后立即进行染色。
2.滴加抗体后孵育要在暗盒内进行。
3.整个染色过程要避免强光直接照射切片。
4.因整个染色过程时间较长，PBS洗时间不要过长，以免脱片。
5.甘油封片后尽早荧光显微镜下观察。
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