（一）组织取材基本要求
（二）注意事项
1.观察和分切标本应快速,避免使其干涸。
2.镊子夹取组织的动作要轻，避免组织挤压和过度伸展。
3.分切组织使用锋利的刀，尽量减少对组织的机械性损伤。
（三）组织固定
目的是保持细胞与生活时的形态相似。
1.常用固定剂 戊二醛、锇酸。
（1）前固定：2.5%戊二醛磷酸缓冲液，pH为7.4,固定时间2h以上。
（2）后固定：1%锇酸，pH为7.4，固定时间2h。
2.注意事项
（1）固定液配制后，置4℃冰箱内保存备用。
（2）组织入固定液后，要摇动观察，防止组织与容器底部或边缘粘连。
（3）戊二醛固定后必须用盐类缓冲液（如磷酸盐缓冲液）充分洗涤，才能入锇酸固定。
（4）组织经锇酸固定后，用双蒸水充分冲洗。
（5）试剂对人体有毒性，操作时要多加小心。
（四）组织脱水
用脱水剂将组织中的水份置换出来。
1.脱水过程
（1）50%乙醇或丙酮10～20min。
（2）70%乙醇或丙酮10～20min。
（3）80%乙醇或丙酮10～20min。
（4）90%乙醇或丙酮10～20min。
（5）100%丙酮30min
（6）100%丙酮30min
2.注意事项
（1）脱水应是完全、彻底的。
（2）用乙醇脱水时的最后两步骤，必须用100%丙酮脱水，以利组织的浸透和包埋。
（五）浸透和包埋
1.浸透包埋剂 环氧树脂包埋剂（Epon812）。
A液 Epon812 10ml
十二烷基琥珀酸酐（DDSA） 16ml
B液 Epon812 10ml
六甲酸酐（MNA） 8.9ml
A液和B液按比例混合，B液比例越大，包埋块越硬（冬天1∶4；夏天1∶9），待上述二液混匀后再按1.5%～2%的体积比，在充分搅拌中滴加DNP-30。
2.过程
（1）脱水后的样品入丙酮、环氧丙烷等量混合液30min。
（2）环氧丙烷30min。
（3）环氧丙烷30min。
（4）环氧丙烷、包埋剂等量混合液4h。
（5）纯包埋剂2h。
（6）包埋操作：将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中，置烤箱烘干，在45℃恒温箱中加热12h、60℃恒温箱中加热24h，即可聚合硬化，形成包埋块。
3.注意事项
（1）所有试剂要防潮，所用器皿应烘干。
（2）包埋时动作要轻巧，避免产生气泡影响切片。
（3）配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀。
（4）包埋块应放于带盖的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋块吸潮变软影响切片。
（六）半薄切片
包埋块的修整：在解剖显微镜下，用单面刀片小心地把包埋块顶端的包埋材料修去，使组织暴露出来。
（七）超薄切片前的准备工作
1.修块。
2.载网、支持膜制备。
3.切片刀准备（玻璃刀、钻石刀）。
4.捞片。
（八）切片染色
1.染色剂配制
（1）醋酸铀：浓度为饱和液。
醋酸铀2g
50%～70%乙醇 100ml
pH4.2
（2）铅盐类
硝酸铅（PbNO)3 1.33g
柠檬酸钠［Na（C6H5O7)·2H2O］ 1.76g
蒸馏水 30ml
将以上试剂放入50ml容量瓶内，用力振荡30min，发生化学反应，结合为柠檬酸铅，溶液呈现乳白色的柠檬酸铅混悬液，然后加入1mol/L氢氧化钠8ml，使柠檬酸铅溶解，变成无色透明状，最后再加蒸馏水至50ml，pH为12。
2.过程
（1）醋酸铀滴染色 15min。
（2）清洗 3次。
（3）柠檬酸铅滴染色 15min。
（4）自然干燥即可电镜观察（图3-23）。
3.注意事项
（1）配液时应选用分析纯试剂。
（2）配液用的双蒸水要新鲜或煮沸冷却后使用。
（3）载网从染液中取出后，必须尽快用蒸馏水冲洗干净。
图3-23 A.内皮下电子致密物沉积；B.上皮下电子致密物沉积（×8000）
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