常规病理制片技术

疾病的发生常具有其各自的形态特征,病理诊断属形态学范畴,通常依据大体标本的肉眼检查和组织切片的显微镜下观察做出。常规病理技术包括取材、固定和石蜡切片的制作。

1.取材 此步骤在技术员协助下由病理医师完成。有经验的病理医师往往能借助大体观察(巨检)确定或大致确定病变性质(如肿瘤的良恶性等)并准确采取到显微镜下观察所需要的检材。

(1)肉眼检查的一般原则:可概括为看、触、切、取。

看:标本的种类、性状、病变的部位、形状、数目、大小、色泽、与周围的关系等。

触:标本的坚度、质地。

切:切面观察标本的结构,囊性时注意内容物的性状和含量。

取:选取合适的组织块切片诊断。

(2)剖验标本的一般原则:虽然标本的大小、形状各不相同,切法有所区别,但应遵循下列原则:①暴露最大切面,其中一个切面须通过病灶中心。②做切面时勿切到底,使一端互相连着,便于观察标本各部分的相互关系。③能显示脏器标本的主要管道分布。

实性标本:一般沿最大面切开,并相隔0.5~1cm做多个平行切面。皮肤、黏膜等标本应由表及里垂直切开,观察横切面。

管状标本:一般从病变对侧将管道纵行剖开。小器官如阑尾、输卵管等可横切数个切面。

囊状标本:无定向,视病变情况选择囊壁厚处或病变穿透囊壁处做多个切面。

(3)取材的一般原则

小块活检组织的取材:内镜所取食管、胃、肠、支气管、膀胱等处组织,肝、肾等穿刺组织及宫颈活检,必须全部取材,标记包埋面,并用吸水纸包裹,以防遗失。其他较小或不规整组织,如刮宫内膜、部分肿瘤组织等,可选择有代表性的病变包埋制片。

大标本的取材:切除的大标本取材应有代表性。不同特点的病变分别取材,不可遗漏重要病变。一般应包括病变、正常组织、病变与正常组织交界处、切缘以及其他附带组织。切片要用墨汁标记,便于镜下观察定位。如系恶性肿瘤,局部淋巴结须分组逐个检出取材。切取组织块的面积一般不超过2.0cm×1.5 cm,厚度不超过3mm。切面须尽量平整。如系骨组织或钙化物质,先行脱钙处理。

2.固定 通过添加固定剂让组织中的所有细胞及细胞外成分迅速死亡,以免细胞中溶酶体成分的破坏作用,保持离体组织细胞与活组织时的形态相似,并防止细菌繁殖所致的腐败,以保存蛋白质与核酸的基本结构。病理标本的制作和组织切片都必须先进行固定。常用固定剂有10%甲醛溶液(福尔马林)、乙醇等。固定应“适当”,其内涵为:①固定方法和固定剂选择恰当(如欲观察糖原,宜选用纯乙醇或Carnoy液作固定液);②固定液量恰当,以常规使用的10%甲醛溶液为例,标本与固定液的比例约为1∶5。③固定时间恰当。一般固定液在24 h内,不能穿透厚度超过3mm的实体组织,或超过5mm的多孔疏松组织。依此推算,大的实体标本,即使采取1cm为间距的书页式切开,按固定液由两面同时透入计算,固定时间也应在24 h左右。但在取材后,因组织块厚度为2~3 mm,依双面透入计,约12 h即可。考虑到10%甲醛溶液固定>24h可能会影响以后的免疫组化效果,故一般情况下,固定时间应为12~24h。较小标本(厚1mm)固定4~6h即可。④因另有目的(如杀死结核杆菌等),其固定时间应在5 ~7d。

手术切除的组织标本,应及时投入固定液中固定。固定液为10%甲醛溶液时其量不得少于标本体积的5倍。标本容器上要标明病人的姓名及所取组织部位、块数,以免混淆。做术中冷冻切片及做酶组织化学染色的标本,均不要固定。胃黏膜和子宫内膜取出后,应先平铺于小滤纸片上,黏膜表面向上,然后放入固定液中。肌肉组织取出后平铺于卡片纸上,按原来肌肉的张力用大头针钉住固定。

各种体液、穿刺液细胞学检查标本应于获取后立即送检。因故不能及时送检时,可经离心沉淀,取沉渣均匀涂片2张,晾干后放入95%乙醇中固定,然后连同固定液或涂片表面涂以甘油后送检。其他如穿刺液涂片、印片、刮取细胞和刷取细胞涂片等,亦应如上固定后送检。

3.石蜡切片 是常规病理最基本的技术,切片制作的优劣、完美与否将直接影响病理诊断的准确性。石蜡切片的制作除组织固定外,还包括脱水、包埋、切片、染色、封片等几个主要步骤。

(1)脱水:利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入。其彻底与否,直接关系到组织是否能充分透明;而脱水过度则容易造成组织变脆。目前绝大多数医院的组织脱水通过脱水机来完成,按一定的程序进行,主要试剂为二甲苯和乙醇。

(2)包埋:用包埋剂来支持组织的过程。其关键一是平整,二是方位。蜡的熔点应在56~ 58℃。

(3)切片:用切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片。切片厚度一般为4~6μm,切片的要求是完整、薄、均匀。

(4)染色:未经染色的组织切片不能直接在光学显微镜下观察。苏木素和伊红染色(HE)是最通用的染色方法。

(5)封片:切片滴中性树胶后加盖玻片封片。