外毛细胞的能动性

（一）纤毛运动与胞体慢运动

通过对鸡和牛蛙的毛细胞纤毛的观察，人们发现将机械刺激施加于静纤毛或电刺激毛细胞胞体，均可引起静纤毛的振荡。其机制可能是：在电刺激下细胞去极化可使静纤毛向兴奋方向主动弯折，或受到直接刺激后静纤毛弯曲时所产生的离子电流经机械－电转换通道流入细胞，进入细胞的各种离子可与毛细胞膜上的适应性动力结构结合，降低静纤毛尖端的连接张力，当动力结构回位，静纤毛恢复原始状态时就产生了运动。这一运动可能参与了非哺乳类动物对声音信号进行放大的过程，但是，哺乳动物耳蜗的毛细胞上尚未发现这种现象。

在长期的实验观察中，人们发现了与电致运动或快运动的机制完全不同的单离外毛细胞长度发生改变的现象，如在细胞浴液中加入一定浓度的钾离子可使外毛细胞产生收缩；当提高胞外钙离子浓度时可使细胞伸长。整个过程在几秒到几分钟时间内完成，所以称为外毛细胞慢运动。目前尚不清楚这一功能对耳蜗放大机制的意义，仅推测慢运动可能与胞内信号传递有关。也许是当某种损伤因素致内、外淋巴液混合后耳蜗功能下降的病理生理机制所在。

（二）电运动

人耳可听到的声音频率在20Hz与20　000Hz之间，并可感受到相差100万倍以上的声强变化。听觉器官的灵敏度与频率选择性分别为听力阈值与语言识别能力的基础。内耳听觉器官的此种高灵敏度和频率选择性都依赖于作为效应器的外毛细胞的主动机械活动。在哺乳动物，放大机制源于外毛细胞随膜电位改变而发生胞体舒缩运动。在听觉频率范围内，外毛细胞能够对声波引起的耳蜗基底膜的振动进行放大和修饰，从而大大提高了内耳敏感性和频率选择性。1985年Brownell发现外毛细胞膜电位的变化能够引起细胞长度改变的现象被称为外毛细胞电运动（electromotility）或快运动。与化学因素诱发的毛细胞长度的改变的慢运动相区别，只有哺乳动物的外毛细胞才具有这种独一无二的电运动的能力，其他内耳细胞如内毛细胞、内耳的支持细胞及非哺乳类动物的短毛细胞（类似于外毛细胞）都不具有电运动的能力。哺乳类动物耳蜗外毛细胞基于动力蛋白（Prestin）产生电运动的同时还具有压电反应，并通过调控基底膜的行波来有效提高听觉敏感度与频率选择性。外毛细胞电运动频率高达110kHz，且不直接依赖于ATP与钙离子的浓度。但研究表明胞内氯离子是触发外毛细胞电运动的电压感受器。同时，外毛细胞电运动对压力变化敏感，电运动的形成依赖于细胞胞质的充盈并保持一定正压的存在。

1．动力蛋白（prestin）　有学者曾在外毛细胞电运动被发现后推测在外毛细胞膜内应存在对膜电压敏感、可发生变型的膜蛋白。随后，郑景通过对外毛细胞和内毛细胞的mRNA进行对照比较后，发现了编码膜动力蛋白（见书末彩图8－4）的基因Pres。据报道prestin的命名来源于声乐术语presto，意为快板，可用于表现外毛细胞电运动高达110kHz的速度。新生沙鼠的外毛细胞膜上即有prestin表达并在出生后6～14d可到达高峰并达到成年鼠的水平。将小鼠Pres基因敲除后，外毛细胞电运动消失，听阈提高50dB左右。与之相反，将Pres基因导入人胚肾细胞后便可记录到原本仅能在外毛细胞上观察到的非线性电容，从而证实了prestin蛋白是外毛细胞电运动所必需的分子基础，所以可通过记录非线性电容来反映外毛细胞电运动的变化。近期的实验数据表明外毛细胞的动力膜蛋白在胞膜上的分布除了主要集中在表皮板以下的整个侧膜上，胞核以下亦有表达（图8－5），修正了胞核以下无prestin表达的推测。值得注意的是同一浓度，同一类型抗体在人胚肾细胞与外毛细胞标本上着色存在较大差异。转染Pres基因后人胚肾细胞中prestin抗体的阳性染色可见于核糖体、高尔基体、胞质、细胞膜这一完整的膜蛋白翻译表达通路，而prestin抗体仅在外毛细胞侧膜上可见明显阳性反应。这一现象可能与外毛细胞侧膜上的特殊结构对prestin蛋白进行加工或修饰有关，但目前尚不知道外毛细胞prestin蛋白是如何更新及其调控的。Dallos早先发现外毛细胞长度的改变仅见于细胞核以上的部位的现象也提示，胞核以下的底侧膜中prestin可能未经修饰而不具有功能。

2．电运动的机制　外毛细胞电运动可以基本跟随声刺激的频率，其响应截止频率高达100kHz，而且并不直接依赖于Ca2＋和ATP的存在，这就与肌肉组织的伸缩机制明显不同。虽然毛细胞的换能电流引起的感受器电位是驱动毛细胞运动的电压来源，但外毛细胞的电运动不是由跨膜电流直接引起的，是在膜电位变化时引起prestin蛋白构型改变而驱动的（图8－6）。prestin是SCL26A5家族中唯一不具有阴离子转运功能的跨膜蛋白，其COOH端有较长的电荷区，蛋白全长有十二个跨膜区，包括电压感受域和构型改变域两个基本的功能区。目前尚不能完全证实prestin是以单体还是多体的形式表达在胞膜上，也不清楚prestin的构型改变是如何导致细胞长度变化的。但将胞内的氯离子用其他单价阴离子置换后，非线性膜电容和电运动均大幅度减弱的现象显示氯离子是触发prestin随膜电位发生构型改变的关键离子，并提出了氯离子门控学说。prestin内有一特殊的结构域可在同Cl－结合后开放一个容许中性分子移动的通道，从而导致prestin的构型变化。当外毛细胞超极化时，prestin氯离子结合位点上结合的氯离子向膜外侧移位引起膜蛋白prestin的构型改变，细胞变长。与之相反，氯离子移向胞质内侧就导致了膜蛋白prestin处于短的构型状态，使细胞变短。另外还有一种阴离子移位学说：带正电荷的氨基酸通过弱连接与prestin蛋白的阴离子结合位点上阴离子相联系，在电场的驱动下这些阴离子在prestin内的移位引起了prestin的构型变化。

图8－5　外毛细胞动力膜蛋白在胞核以下的表达

A．耳蜗外毛细胞抗prestin－C抗体免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下的表达；B．同一外毛细胞在相差显微镜下所见（标尺10μm）

图8－6　两个关于氯离子调控prestin蛋白的模型（引自Ashmore，2008）

模型一：在膜电场的驱动下胞内氯离子进入prestin胞质侧的间隙中，与prestin蛋白上特定位点结合后引起侧膜构型改变。作为抑制剂，水杨酸钠可与氯离子竞争性的结合这一位点。数据表明此模型与模型二是相吻合的。模型二：与氯离子结合相关的，内源性电荷运动所引起的构型改变

（三）电运动与非线性电容

全细胞电压钳（图8－7）与微室技术是研究外毛细胞电运动的常用方法。全细胞电压钳方法的优点是可以在有效地控制膜电位的条件下记录电流变化，其缺点是容易造成细胞内细胞因子的丢失及细胞完整性的破坏。微室技术是将细胞部分吸入一个玻璃微管后刺激外毛细胞，其优点是细胞完整，但很难控制细胞膜电位，外毛细胞电运动时外毛细胞的收缩幅度要比舒张幅度大，并在刺激强度较大时出现饱和现象，此现象与毛细胞感受器电位相似，具有不对称和非线性的特点。电致运动的幅度也与膜电位有关。经测量外毛细胞电运动的最大敏感度是5～20nm/mV，当膜电位在－60mV到0mV之间时外毛细胞电运动的幅度可达最大，其最大幅度约为外毛细胞长度的5%。

图8－7　全细胞电压钳模式下记录豚鼠耳蜗外毛细胞非线性电容

A．记录到的非线性电容，光滑线条为拟合曲线；B．形成全细胞记录的外毛细胞光镜所见

Santos－Sacchi的工作证实了一种与外毛细胞电运动相关的非线性充电过程或者说是电压依赖的非线性电容（Non－Linear Capacitance，NLC），且可以通过测量这种非线性电容来反映电运动的变化（图8－5）。因为测量膜电容要比直接测量毛细胞运动要容易，故应用较多。外毛细胞的膜电容包括线性电容和非线性电容两部分。线性电容部分源于细胞膜的脂质双层，电容的大小不受外界条件影响，由表面积大小决定。非线性部分主要来自prestin及相关的离子通道的开启与关闭的结构。在记录过程中，常用相应的离子通道阻断药将通道阻断以去除其影响，而后记录到的非线性电容仅与prestin有关。非线性电容的大小与动物种类及细胞的大小有关，豚鼠耳蜗外毛细胞的非线性电容可达30～35pF，而小鼠耳蜗的外毛细胞的非线性电容一般仅有7～10pF。

Santos－Sacchi记录非线性电容的实际过程是在高分辨率的采样时间下，给予外毛细胞两个不同频率的正弦波（如390．6hz和781．2Hz），幅度为10mV的刺激程序，得到一个伴随电压变化的电脉冲记号，所记录的数据经快速傅立叶变换（FFT）处理后可反映电压依赖性膜电容的大小。电压依赖性膜电容与电压依赖性离子通道开启时的门控电流相似，后者是由膜两侧带电荷的电压敏感位点在电场中移动和重新分布所产生的，门控电流表现为非线性膜电容的一个组成部分。非线性电容的峰值经总的细胞电容减去线性部分后得到，电容－电压数据借助源自量子力学的Boltzmann方程描述，其电容拟合方程式如下所示。其中参数：Cm为膜电容，Clin为线性电容，Qmax为最大电荷传输量，Vm为膜电压，Vh为相同电荷分布的电压，z为基本电荷数，k为Boltzmann参数，T为绝对温度。

（四）外毛细胞的压电反应

在听觉换能过程中，活体耳蜗外毛细胞在产生感受器电位的同时亦承受因基底膜振动所带来的机械刺激。文献报道外毛细胞具有与压电晶体相似的特性，即能在受到外界刺激时将电转换成机械运动的同时，也将机械刺激转换为电反应并产生电流，产生的电反应与电流的大小均与刺激幅度和速率呈相关性，还可使相邻外毛细胞间产生侧抑制，从而提高听觉敏感特性。机械刺激能够诱发最大20mV的电位变化，其电流幅度也在40pA以上。外毛细胞膜的R－C低通滤波特性在高频时对感受器电位会有衰减，理论上推测应该有某种元件可以对其进行补偿。prestin转染细胞上出现压电反应的结果证实，压电现象应源自prestin蛋白。膜片钳研究中，细胞膜的生物特性通常理论上可用电阻电容电路的原理来分析。因膜电容的存在，外毛细胞膜可看为一个具有较低截止频率的低通滤波器。据此，有学者通过理论计算后认为prestin蛋白构型改变的频率虽高达110kHz，但其驱动力（跨膜电位）的高频部分可被低通滤波器大幅度衰减，从而质疑外毛细胞是否具备进行高频机械－电能转换的基础。对外毛细胞膜理论上的R－C低通滤波特性与实际频率响应之间差异的研究一直是听力基础研究领域的热点与难点。目前已知这种压电特性的生理意义在于外毛细胞的高频响应能够被明显的提高，并可使相邻外毛细胞间产生侧抑制从而提高听觉的敏感度，这在一定程度上证实了外毛细胞的压电特性可用来补偿感受器电位在高频时的衰减。

压电反应是哺乳动物听觉功能适应进化的需求。在生物进化过程中，为适应环境的变化，哺乳类动物的听觉频率变得更为宽广。例如，6　000万年前，蝙蝠为了适应夜间的捕食环境，形成了频率高达50kHz的回声定位系统。随着听觉频率的范围向高频扩展，基底膜在共振中就必须有效地克服耳蜗中的黏性阻尼。而外毛细胞底部经Deiter细胞连接于基底膜上，顶部借助表皮板与其他细胞之间紧密连接共同形成网状板（reticular lamina）。在这种活体结构中，外毛细胞的负载不同于单离外毛细胞，来自周围的共振阻抗在弱化黏性阻力峰值的同时拓宽了共振范围。而网状板的走向与基底膜底面平行的结构，使外毛细胞的高频共振容易叠加并得以克服阻碍共振的阻尼。由此可知，正是基于压电反应的外毛细胞高频共振，耳蜗能够在听觉活动对R－C误差进行有效补偿并提高了外毛细胞的高频感受器电位，以使哺乳类动物更好适应严酷生存需求。

（五）外毛细胞电运动对耳蜗主动放大机制的作用

在对听觉机制的研究中，越来越多的实验证据间接地提示了耳蜗主动放大机制的存在。1948年，Gold认识到耳蜗活动中需要有额外的能量来克服黏性阻力，并提出了耳蜗中可能有主动机械运动的推测。Kemp发现的耳声发射则证实了耳蜗主动放大机制的存在。因为Béskésy的基底膜振动模型难以解释耳蜗所具有的极高的灵敏度和频率选择性，Davis的耳蜗放大器的理论随之出现。在Brownell发现外毛细胞电运动后，耳蜗主动放大机制的理论得到进一步的确认。自此关于外毛细胞电运动的研究成为耳蜗放大机制研究领域中的难点与热点。因为外毛细胞电运动可能就是耳蜗主动过程的能量来源。随着研究的深入，耳蜗主动放大机制理论得到不断补充和完善。耳蜗主动放大机制是耳蜗功能重要特点之一，是深入理解耳聋机制的重要基础。

（六）耳蜗支持细胞及缝隙连接对外毛细胞电运动的调控

图8－8　耦合细胞间直接跨膜缝隙连接通道方式

对哺乳动物而言，缝隙连接通道由两个来自不同细胞的连接小体（connexon）组成，每个连接小体又由6个连接蛋白（connexin）构成

耳蜗支持细胞上有大量缝隙连接蛋白（connexin）的表达，支持细胞间依靠缝隙连接而相互连接耦合（图8－8）。虽然外毛细胞上没有缝隙连接蛋白的表达，外毛细胞间也不存在缝隙连接耦合，但编码组成缝隙连接蛋白的connexin基因突变致缝隙连接失去功能则会引起严重的听力损失。临床病例及实验室数据均已证实，connexin　26（Cx26）基因突变后畸变产物耳声发射会明显降低甚至完全不能被引出。这就提示支持细胞及细胞间的缝隙连接耦合状态与外毛细胞电运动之间可能存在极大相关性。同时，外毛细胞的压电反应（piezoelectricity）在保持耳蜗频率响应中起着重要作用。基于外毛细胞与Deiter细胞的结构关系，当通过缝隙连接耦合在一起后，大量同步化的Deiter细胞可对外毛细胞的初始及运动状态调控进行调控，进而在很大程度上为耳蜗功能的正常发挥创造了条件（见书末彩图8－9）。

耳蜗支持细胞上connexin蛋白主要为Cx26与Cx30两种蛋白。最新研究表明Cx26和Cx30在耳蜗内的分布既有差异又有重叠，存在着细胞分布特异性。在Deiter细胞与柱细胞的指突同毛细胞所构成的网状板上，Cx26和Cx30有着大量表达，并相互重叠；在Deiter细胞和柱细胞的胞体也有大量Cx26和Cx30的表达。缝隙连接通道门控的开放与关闭受细胞电位、pH、钙离子浓度或细胞膜紧张度等因素的影响，并且对跨缝隙连接通道的电位差或细胞膜电位的变化敏感。不同类型的connexin蛋白其电压敏感度亦不相同。因同源蛋白构成的同型通道结构对称，从而其电压门控特性呈现对称性的特点。异源型（异型或异侧）通道结构相对复杂。异源型缝隙连接通道由两个不同的半通道组成，因每个半通道均有其独特的门控特性，故异源型通道电压门控具有不对称性的（或非平衡性）特点。将编码connexin蛋白的基因共转染至卵母细胞上所形成的由Cx26与Cx30两种蛋白构成的异源型通道显示了非对称性电压门控特点。近期的文献报道在脂质体上Cx26与Cx30两种蛋白可混合构成更为复杂的异源型半通道。在缝隙连接形成耦合的耳蜗支持细胞间，可记录到多种不同类型的电压门控方式，同时也发现跨膜整流电压门控具有明显的极性特点。对于左－右型通道而言其电压门控也处于非对称状态。缝隙连接组体对于细胞膜电位的变化也非常敏感，也不同于跨通道电压依赖性，缝隙连接膜电位的门控特性也显示出非对称性。不平衡型的电压门控还可引起一个直接的单向跨膜电流，此类跨膜电流可能是缝隙连接功能的一种体现，并提示耳蜗支持细胞间的缝隙连接能在听觉灵敏度的调控过程中直接发挥作用，这将为全面深入研究connexin缝隙连接蛋白突变及缝隙连接在维持正常听觉功能中的作用提供新的思路。

（于　宁）

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