耳蜗内毛细胞及传入神经递质

（一）耳蜗传入神经递质谷氨酸

谷氨酸（Glutamatic acid，Glu）在耳蜗毛细胞中的分布，早期由Godfrey等进行的显微切片化学分析发现，Glu在耳蜗Corti器毛细胞中含量较多。这些结果后来被免疫组织化学实验所证实。然而，免疫电镜实验研究未能发现Glu在耳蜗毛细胞突触囊泡中的聚集。一般来说，作为神经递质而存在的Glu，在毛细胞突触囊泡内的含量应是浓聚状态，毛细胞突触囊泡内的Glu在每一次释放后应该得到补充，已探明这一过程是由囊泡膜上依赖ATP的质子泵所产生的电化学梯度来实现的。Usami等认为，在耳蜗毛细胞突触囊泡中未见Glu聚集的原因，一方面是由于耳蜗毛细胞对刺激特别敏感，即使是在活体耳蜗外淋巴灌注固定（认为这是耳蜗标本固定的最好方式）过程中，一些理化刺激（包括声刺激）也可引起毛细胞突触前囊泡中Glu的生理释放；另一方面是由于耳蜗Corti器对缺血、缺氧异常敏感，在耳蜗标本得以固定前，由于毛细胞的能量衰竭导致了其突触囊泡中Glu丢失到细胞质中。谭祖林用Glu免疫金颗粒密度来观察证明，噪声暴露后即刻Glu免疫金颗粒密度降低而后接着增加，提示噪声暴露后IHC传入突触确有Glu释放。

（二）Glu对IHC胞内［Ca2＋］i的影响

李兴启等的研究表明外源性谷氨酸可引起离体内毛细胞内的钙离子浓度增加，表明谷氨酸对内毛细胞上的自身受体的作用是一种正反馈调节。当谷氨酸刺激内毛细胞，内毛细胞膜上的钙通道打开，Ca2＋浓度增加。作为一种第二信使，细胞内Ca2＋的增加可引起谷氨酸的释放，而谷氨酸作为一种神经递质与内毛细胞内的Ca2＋之间是一种正反馈调节。

（三）Glu受体

谷氨酸受体分为属于配体门控离子通道的离子型受体（iGluR）和G蛋白耦联的代谢型受体（mGluR）。离子型受体分为NMDA （N－methyl－D－aspartate，N－甲基－D－天门冬氨酸）受体和非NMDA受体，NMDA受体包括NR1和NR2两个亚型，非NMDA受体分为AMPA（1－4－isoxazolepropionate，AMPA，α－氨基－3羧基－5甲基异唑－4丙酸）受体和海人藻酸（KA）受体。AMPA受体包括GluR1－GluR4。谷氨酸受体广泛分布于哺乳动物的听觉系统中。

1．在耳蜗毛细胞传入神经突触中的突触后膜Glu受体　是何种受体参与耳蜗毛细胞传入神经突触的突触传递呢？免疫电镜观察表明，在与IHC相连接的放射状神经突触末梢的突触后膜上未见有AMPA受体的GluR1亚型，而有GluR2/3和GluR4亚型；在与OHC相连接的传入神经纤维突触后膜上未见到AMPA受体任何亚型。到目前为止，在耳蜗毛细胞传入神经突触后膜上尚未发现有代谢型谷氧酸受体。

2．在毛细胞传入神经突触中的突触前膜Glu受体　在进行免疫电镜观察的超薄切片上，沿着与IHC传入神经突触间隙相垂直的轴来记录免疫胶体金的分布，发现标记GluR2/3的金颗粒只表现在IHC－传入神经突触的突触后膜上。而标记GluR4的金颗粒却表现在突触后膜与突触前膜两处，这提示AMPA受体的GluR4亚型也存在于突触前的IHC上。同样，在前庭毛细胞上也发现有突触前AMPA受体。但也有实验证明IHC膜上主要存在NMDA受体。谷氨酸的生理作用和病理作用都是通过谷氨酸受体实现的，且主要是通过突触后膜的离子型谷氨酸受体。

（四）传入突触的分子构成

传入突触由内毛细胞和Ⅰ型传入听神经的树突的突触小结构成。在哺乳动物耳蜗，每个内毛细胞有10～30个活动区，每一个活动区只与一条传入神经纤维的突触小结形成突触连接，这样内毛细胞上的一个活动区就提供了一条传入神经纤维上的所有听觉信息。

内毛细胞形成的传入突触位于内毛细胞基底侧膜，其显著特点是具有呈带状的、被称为突触体的结构。突触体位于突触的活动区、邻近突触前膜，有直径30～50nm清亮核的突触囊泡，囊泡通过细丝固定其上。内毛细胞每一个活动区一般只有一个突触体，另外突触体与突触前膜之间也存在纤维性的连接。突触体也见于其他一些感觉细胞，如视网膜的感光细胞双极细胞及味蕾。突触体结构被认为是感觉细胞特化的与神经递质紧张性释放有关的结构。

内毛细胞传入神经递质Glu的释放是通过毛细胞膜上的电压敏感的L型钙通道的激活所引起的，而这种L型钙通道的激活可通过毛细胞纤毛束的偏移所导致的膜电位梯度变化而产生。毛细胞的L型钙通道与其他细胞的L型Ca2＋通道不同，它们具有特别高的激活和失活速度，它们比其他细胞L 型Ca2＋通道被激活所需的电位低20～50mV。除了能够触发毛细胞传入神经递质Glu的释放以外，L型Ca2＋通道还是毛细胞频率调谐过程所必需的，某些毛细胞仅对某一频率范围的声刺激产生反应而表现出电位共振，有证据表明这种电位共振依赖于L型Ca2＋通道与Ca2＋激活的K＋通道两者的共同作用来完成。Roberts等在电镜下观察到离体蛙的球囊毛细胞上几乎所有的L型通道和Ca2＋激活K＋通道呈大约20簇分立于毛细胞的基底侧膜上，而从连续切片的电镜观察中发现每个毛细胞上大约有20个传入突触连接，因此认为每簇离子通道对应一个传入突触连接。在用Ca2＋敏感染料fluo－3标记的共聚焦显微镜观察中，发现球囊毛细胞的Ca2＋内流正好出现在细胞基底侧传入突触区，每个细胞平均有18处表示Ca2＋内流的荧光浓聚区，这个数目与Roberts等的电镜观察结果很接近。由于L型Ca2＋通道与内耳毛细胞传入神经递质Glu的释放相关，而过量释放的Glu通过传入神经树突末梢上突触后Glu受体的过度激活，可引起内耳毛细胞下传入神经纤维的病理改变，因而有人用L型Ca2＋通道拮抗药硫氮酮成功地拮抗了Glu和海人藻酸（KA）对毛细胞传入神经突触的毒性反应。

（五）Glu在耳蜗信息传递中的作用

IHC兴奋后释放出神经递质Glu到突触，并与突触后膜上的谷氨酸递质受体相结合，激活与Glu受体相耦联的Na＋离子通道开启，Na＋内流使传入神经末梢去极化，从而产生动作电位。但也有报道可能激活了与谷氨酸受体相耦联的Ca2＋通道开启，Ca2＋内流使神经末梢去极化。但后者引起的是幅度低、下降缓慢的动作电位。

早期由Klinke和Bobbin进行的电生理实验发现，高浓度（10mmol/L）的谷氨酸降低听神经复合动作电位（compound action potential，CAP），而不影响毛细胞水平的突触前电位－耳蜗微音器电位（cochlear microphonics，CM）。CAP代表传入神经纤维的同步放电。有假说认为谷氨酸引起的CAP幅度的降低不是因为抑制效应，而是由于传入神经纤维放电率增加而导致初级听觉神经元去同步，进而引起初级听觉神经元对声音的敏感度降低。Felix用微离子渗透法将谷氨酸透入内毛细胞传入神经突触区，发现听神经自发性放电率的升高，从而证实了上述假说。然而，这个假说受到Gleich等的挑战，他们将谷氨酸灌注到鼓阶外淋巴后观察到四种不同效应：①自发性放电率不变而声诱发放电率下降；②自发性放电率升高，偶尔在随后有下降；③自发性和诱发性放电率均下降；④声诱发放电率下降至自发性放电率以下。而且他们发现灌流时需要高浓度（非生理浓度）的谷氨酸才能产生听神经自发性放电率的改变：谷氨酸浓度＜2mmol/L时，听神经放电率无影响；谷氨酸浓度为2mmol/L时，大约只有60%的听神经放电率有变化；谷氨酸浓度达到5mmol/L时，听神经放电率才有显著的变化。据此，Gleich等认为谷氨酸不是内毛细胞的传入神经递质。然而，如果考虑到耳蜗结构能够有效地清除细胞外的谷氨酸（见谷氨酸失活机制），我们就会明白：尽管从外部给予的谷氨酸浓度很高（达数个mmol/L），而耳蜗结构对谷氨酸的强大吸收力使得外部给予的谷氨酸很快就会被稀释。至于上述外源性谷氨酸对听神经放电率的不同效应，可以作出这样的解释：①外源性谷氨酸给予方式不同；②外源性给予的谷氨酸既不能模拟在突触前的量子式释放，也不会只限于突触后部位，从而其作用效果不一致。因此不能排除谷氨酸作为耳蜗内毛细胞的传入神经递质这种可能性。孙勍等行全耳蜗灌流Glu发现CAP幅度下降，阈值提高，但CM的输入和输出函数曲线仍然具非线性特点，提示Glu为一传入神经递质，且过多的Glu会选择性破坏IHC和传入突触。从CAP阈值的变化看，行全耳蜗灌流，人工外淋巴液组灌流2h后CAP阈移为（2．0±2．8）dB，与灌流前相比无明显变化；灌流10mmol/L谷氨酸2h后CAP阈移为35．00±3．33dB，较灌流前明显提高（P＜0．05）。提示CAP的阈移与Glu毒性呈剂量依赖关系。

从耳蜗形态学的变化看灌流人工外淋巴液组，透射电镜结果显示内毛细胞形态正常，内毛细胞下传入神经纤维结构完整（图15－2A）；外毛细胞胞膜及胞核完整，胞质均匀（图15－2B）。灌流10mmol/L谷氨酸后，应用透射电镜观察发现内毛细胞及内毛细胞下传入神经纤维中有空泡形成（图15－2C），外毛细胞结构正常（图15－2D）。结果提示，Glu兴奋性毒性确实可造成传入神经纤维变性改变。

图15－2　灌流人工外淋巴液和灌流10mmol/L谷氨酸前后内、外毛细胞的形态变化