聋病基因功能研究的新策略

感音神经性聋常由多种疾病、噪声、耳毒性药物、遗传基因异常和老年化等因素所致，是耳鼻咽喉科临床常见病。据最新估测，我国现有不同程度的听功能障碍者约6　000万，而每年新增加的聋儿近3万人。虽然既往对听功能进行的大量研究已有很大进展，但目前对感音神经性聋的治疗仍是一大难题。人类基因组计划已经完成，并且进入功能基因组和蛋白组学的研究，对听功能基因的研究也将随之进入新的时代而面临新的机遇。

（一）耳聋基因或听觉基因

耳聋基因的发现提供了令人振奋的机遇，即从分子水平揭示听力发生及听力下降的机制。既往应用一些生物化学手段研究听觉功能的分子机制，收效甚微的原因是听觉系统的组织结构深在，组织含量少，如转导通道上的主要分子，在每个毛细胞中只有几十个拷贝，而且听觉器官相对于其他的感觉器官而言目前尚缺乏可以应用候选分子进行功能研究的理想模型。直到20世纪90年代，快速发展的分子遗传学研究手段使科学家们在破译耳聋基因及听觉功能的研究方面取得了突破性的进展。听觉基因的发现在我们面前展示了一个全新的画面，即从不同的层面揭示听觉功能的分子奥秘。了解这些基因在听觉系统中毛细胞结构、细胞外基质、离子内环境稳态、转录因子等各个方面的作用以及他们对耳聋表型的影响，将使我们对听功能异常的分子病理机制的理解达到一个新的高度。但是，从功能基因组学角度看，仅仅发现和克隆聋病基因还远不是我们想达到的目标，而是需要进一步深入研究基因的功能，为聋病的防治提供理论依据。

（二）基因敲除技术

基因敲除是近年来发展和成熟起来的一项生物学新技术。通过在小鼠胚胎干细胞（embryonic stem　cell，ESC）基因组水平的同源重组，造成目的基因的缺失突变，可以了解基因失活后对发育、生长、衰老以及器官、组织或细胞结构功能的影响，从而确切地从整体水平研究基因功能，同时建立某些疾病的动物模型。目前，这一技术已在生物学和医学研究中得到广泛采用，并在一些领域取得重要进展。可以预见，利用基因敲除技术也使得我们有可能在体研究听觉相关基因并对聋病候选基因进行筛选。通过对内耳形态和听功能的系统研究，体现了功能基因组学的研究方向，并且可以建立基因缺陷致聋的动物模型。

（三）基因打靶技术

军事医学科学院基因工程研究所，用基因打靶技术研究SMADs基因的功能方面已经取得大量研究经验和成果，并独立研制基因剔除小鼠和基因敲入小鼠模型，包括SMAD3，SMAD4，SMAD5完全基因剔除小鼠和SMAD4条件基因剔除小鼠。SMADs基因是最新发现的哺乳动物体内转化生长因子－β（transfoming growth　factor－β，TGF－β）信号转导途径中一个重要的新基因家族。TGF－β细胞素超家族由TGF－Ps、活动素（activins）、抑制素（inhibins）、骨形态形成蛋白（bone morphogenetic　proteins，BMPs）等分泌型的多肽信号分子构成。TGF－β信号分子通过调节细胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡而在生物整体及各种器官的发育过程中起重要的作用。SMADs是转导细胞质内TGF－β信号的分子，它们可以将TGF－β信号直接由细胞膜转导入细胞核内。由于TGF－β是一种自分泌或旁分泌的、可抑制上皮细胞和淋巴细胞等多种细胞周期的细胞因子，TGF－β信号通路中的任何一个环节的分子发生特异性的遗传突变都可能提供一种选择上的优势使得细胞逃脱TGF－β介导的生长控制。因此，SMADs基因家族的多个成员均被认为是可能的肿瘤抑制基因。SMADs基因的缺失和突变已经在多种人类肿瘤中发现。近几年中，对SMADs的研究以惊人的速度发展。建立SMADs基因剔除（knockout）小鼠模型也极大地帮助研究者理解TGF－β是怎样在体内转导的。SMADs家族目前有9个成员，分成受体激活型、通用型和抑制型三类。不同的成员在信号转导过程中起不同的作用。受体激活型也称受体调节型SMADs，包括SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5及可能的SMAD8，它们可与Ⅰ型受体直接作用并被磷酸化。通用型SMAD目前只发现SMAD4，它与其他SMADs家族成员的同源性较低，不能与TGF－β或Ⅰ型受体结合也不能被磷酸化，但它可与SMAD家族的其他成员相互作用并形成稳定的异源三聚体，而这种异源三聚体是TGF－β信号转导所必需的。SMAD6和SMAD7属于抑制型SMADs，因为它们可通过竞争性地与Ⅰ型受体结合而抑制其他受体激活的SMADs的磷酸化作用，从而阻断TGF－β超家族中多种成员的信号转导。Smads基因在脊椎动物发育中的功能对于了解它们介导的TGF－β信号在包括肿瘤在内的多种人类疾病中的可能作用有重要的意义。

（四）基因剔除与胚胎发育

研究发现，SMAD4、SMAD5基因剔除导致小鼠在胚胎发育早期死亡。作为信号途径中重要的一个环节，其基因剔除导致如此严重的表型也可以说是意料之中的，但是，这种早期中胚层的缺陷能被突变胚胎与四倍体野生型胚胎的融合所拯救。令人惊奇的是我们在对SMAD杂合型（＋/－）小鼠表型分析中发现，与野生型小鼠比较，双盲测听检查意外发现突变鼠听力明显下降。以此为切入点，我们进行了大量的听功能和内耳形态的研究，发现SMAD4、SMAD5基因剔除确实可以导致小鼠严重听力障碍，而且内耳听觉器官包括毛细胞、支持细胞和螺旋神经节等出现不同程度的损害。其他研究小组报道SMAD基因和BMP信号通路可能参与内耳发育和内耳细胞分化并发挥重要作用，Chang等用原位杂交技术检测到Smad5在鸡的胚胎时期的内耳囊中有表达；Bmp4信号通路通过负向调节内耳前体细胞增殖参与内耳感觉上皮的产生，进而Bmp4促进了毛细胞的分化。我们的研究也发现SMAD4和SMAD5在内耳确有表达。上述研究结果支持了我们SMAD基因敲除导致耳聋的新发现，并已集中报道。

在上述研究的基础上，我们已经建立了一个基因缺陷导致聋病的动物模型，作为听功能基因研究新的平台，它将对听觉基因功能和聋病的分子机制进行探索研究，以此作为聋病基因研究的新策略，从而为最终的聋病基因治疗提供理论上的实验依据。

（杨仕明）