(一)糖尿病模型
2 型糖尿病中的成年型是常染色体显性遗传的单基因疾病,主要表现为胰岛素分泌不足和(或)胰岛素抵抗。在可能引起其发病的基因当中葡萄糖激酶基因突变最为多见。完全基因敲除葡萄糖激酶的纯合子小鼠由于出现非常严重的高血糖在出生后不久死亡。Zhang等为了研究肝细胞葡萄糖激酶在维持血糖平衡的作用研制成一种糖尿病的动物模型,应用条件基因敲除技术将肝细胞葡萄糖激酶基因剔除,形成了糖尿病小鼠模型。这些小鼠出现随着年龄增长,血糖升高,在6周时空腹血糖显著高于对照组,葡萄糖耐量降低。这种小鼠还可以应用于糖尿病药物的开发、研制及筛选。
肥胖和胰岛B细胞缺乏之间的分子生物学联系而引发糖尿病的疾病模型建立是很困难的,Lin等应用条件基因敲除技术将胰岛素受体酶解物2(Irs2)基因在小鼠的胰腺B细胞和部分脑组织中剔除,从而引起小鼠食欲旺盛、体重增加、胰岛素抵抗,逐渐演变为糖尿病。当小鼠生长到6~10个月时,表达Irs2的具有功能的胰岛B细胞再生,补充后的胰岛B细胞功能足以对抗胰岛素抵抗后糖尿病症状消失。Irs2信号促进胰岛B细胞再生和维持体内营养素的稳态,这种功能避免了小鼠出现肥胖和糖尿病。
(二)神经系统疾病模型
编码核染色质重塑的一类基因的突变,例如ATRX基因,可以引起一些包括X连锁智力发育障碍综合征的遗传性疾病。它们所控制的蛋白在正常中枢神经系统中的作用还不清楚。利用条件基因敲除技术敲除ATRX基因使其在小鼠前脑失活,进而引起新皮质和海马回细胞数量减少和前脑大小明显缩小。这一现象是由于在突变小鼠皮质形成早期的神经细胞凋亡引起的。因此说明ATRX基因是在早期神经细胞分化至关重要的调节因子,神经组织的大量缺失导致了严重的神经发育障碍。
完全敲除alphav integrins基因的胚胎小鼠,由于其血管和脑实质细胞缺乏联系而出现大脑内出血。使用条件基因敲除小鼠来研究这种大脑出血是由于血管细胞还是神经细胞的缺陷引起的。条件敲除alphav integrins基因在血管内皮的表达,并没有发现对大脑血管的影响。然而条件敲除alphav integrins基因在中枢神经系统胶质细胞的表达可以导致胚胎鼠或新生小鼠的脑出血。除了神经系统的缺陷,30%的条件基因敲除模型小鼠出现癫和出生后四周的死亡。其余幸存小鼠可以存活几个月,但都有脊髓和小脑的变性,出现了共济失调。这些都说明了alphav integrins基因在胚胎期大脑血管发育的至关重要的作用,同时也发现了alphav integrins基因在出生后中枢神经系统轴索上的表达。
结节性硬化症可以严重影响中枢神经系统,引起癫,智力迟钝,孤独症,神经胶质瘤等一系列症状。TSC1and TSC2这两个基因中任意一个产生突变,都可以破坏它们蛋白产物之间的正常相互作用,进而引起相似的疾病表型。在脑组织中敲除这些基因,可以导致异常的细胞分化,移行,增殖,产生特征性的脑损伤—皮质结节。利用完全基因敲除和条件基因敲除技术可以生成结节性硬化症的动物模型,表现出一系列结节性硬化症的临床症状,为研究TSC1and TSC2的基因功能提供了非常有价值的工具。
γ-氨基丁酸(GABA)受体是γ-氨基丁酸的神经递质G蛋白耦联受体。γ-氨基丁酸(GABA)受体在神经系统内可以广泛地表达,它们在小鼠体内完全的缺失可以导致小鼠胚胎期的死亡。即使小鼠幸免存活下来,也有癫、记忆缺失、痛觉过敏、机体功能亢进的表现。因此在时间空间限制γ-氨基丁酸的功能可以使得研究其受体缺失后的异常表型成为可能。应用CRE-LOX P系统,制成条件基因敲除小鼠,这种小鼠没有GABA受体的缺失,不能合成GABA蛋白,表现出研究者期望的行为异常,从而为研究者提供了很好的实验动物模型。
He等假设脑源性神经营养因子(brainderived neurotropic factor,BDNF)在海马激活其受体TrkB是在癫形成过程中必需的步骤。为了验证其假设,他们利用条件基因敲除技术制作成BDNF(-/-)和TrkB(-/-)两种可诱发癫的动物模型。在BDNF(-/-)小鼠中尽管BDNF表达显著减少,但是癫症状无明显减轻,在海马被激活的TrkB却增加了。与之相比,在TrkB(-/-)小鼠中异常脑电生理信号减少,没有发作的癫出现。研究显示了TrkB和其下游信号传导通路是利用药物控制癫的分子研究热点。
(三)条件基因敲除技术在肿瘤研究方面的应用
转化生长因子β是在生理功能上与调节发育、细胞增殖和免疫反应有关的生长因子。转化生长因子β信号传导在乳腺肿瘤发生上的机制是复杂的,在功能上使肿瘤抑制或肿瘤促进均有报道。为了阐明转化生长因子β信号传导在乳腺发育,肿瘤发生、转移的作用。研究者将编码转化生长因子β-Ⅱ型受体(transforming growth factor-βreceptor 2,TGFβr-2)的基因在小鼠乳腺上皮上进行条件基因敲除,失去TGFβr-2后,小鼠乳腺出现小叶泡状增生及增多的凋亡细胞。这种小鼠与乳腺转移癌转基因小鼠交配后出现肿瘤潜伏期缩短,肺转移概率增加。说明了转化生长因子β信号传导在乳腺肿瘤发生上的抑制作用,也证明了在肿瘤细胞中缺乏转化生长因子β信号传导时肺转移发生率增加。
E2F1基因是成视网膜母细胞瘤蛋白(pRb,一种抑癌蛋白,参与细胞周期调控)通路的重要下游效应基因。应用条件基因敲入技术将E2F1基因融入雌二醇受体配体结合域而表达人类E2F1蛋白。结果E2F1基因的短期激活导致了E2F1靶基因的活性增高和生殖细胞的凋亡。这种凋亡反应是不依赖p53基因的。E2F1基因的活性如果持续三周,可以引起广泛的凋亡反应和睾丸萎缩,睾丸组织中有雌二醇-E2F1基因的高度表达和过度的有丝分裂活性。此外生殖母细胞样的生殖细胞发育不良也可出现,这很类似人类的原位癌细胞。实验结果显示了E2F1基因活性在睾丸组织的短期增强可以诱发癌恶变前的改变。
PTEN基因的体细胞突变可以在包括恶性胶质瘤在内的许多种肿瘤中被发现。它在恶性胶质瘤中的出现率可以达到25%~40%,但是在低度恶性的神经胶质肿瘤却很少出现。为了研究PTEN基因在胶质细胞瘤中形成的作用,研究者应用Cre-lox P系统进行了胶质细胞的PTEN基因条件基因敲除,PTEN基因条件基因敲除小鼠显示出全脑组织的进行性增大。在胶质细胞和神经细胞中都可以观察到细胞核和细胞体的增大,这些变化都增大了脑组织的大小。缺乏PTEN基因表达的胶质细胞在体内和体外试验都出现异常的增殖,而缺乏PTEN基因表达的神经细胞无异常增殖的改变。
Rb基因是一种抑癌基因,它的基因突变无论在人类还是动物模型都已经发现与前列腺癌的发生有关。在欧美临床数据显示60%以上的前列腺癌患者都观察到Rb基因位点的突变。Maddison等利用条件基因敲除技术敲除了小鼠前列腺上皮细胞中的一个Rb等位基因,发现前列腺组织有局灶性的细胞增生,由此建立了Rb基因突变引起早期前列腺癌的动物模型。动物生长到52周时并没有表现出恶性,而是显示疾病早期表现,并且多病灶性的特点很类似临床患者。研究表明失去Rb基因调节的细胞周期控制直接导致了增殖性前列腺疾病的出现,但是并不足以引起恶性改变。这一模型有助于完整表现早期前列腺疾病和解释Rb基因突变促进前列腺癌的形成和转移的分子机制。
(四)条件基因敲除技术在骨骼系统发育研究中的应用
核孤儿受体COUP-TFⅡ在胚胎发育过程中可在多种组织或器官进行广泛表达,这都表明COUP-TFⅡ在很多方面参与胚胎发生。由于COUP-TFⅡ完全敲除的小鼠在胚胎早期的死亡,COUP-TFⅡ在肢体发育的功能还不能够被认识。COUP-TFⅡ在侧板中胚层的表达式早于肢芽的形成,它在体节和肢体骨骼肌干细胞也有表达。为了研究它在肢体和骨骼肌发育的潜在作用,制成了COUP-TFⅡ条件基因肢体敲除的模型。失去了COUP-TFⅡ表达的肢体出现骨骼肌发育不全或是短肢。结果说明了COUP-TFⅡ在肢芽生长早期以及四肢的骨骼肌肉系统的作用是必不可少的。
TGF-β家族成员是信号转导蛋白,它们可以调节包括骨骼组织的生长和分化等发育过程的很多方面。TGF-β有三种亚型,它们都是通过异型三聚体发挥作用。为了研究TGF-β信号转导在骨骼发育过程中的作用,应用Cre/lox P系统将TGF-βⅡ型受体基因(Tgfbr2)进行条件基因敲除而制成动物模型。研究发现在模型小鼠的颅底和椎骨出现多重的缺陷。在椎骨的内径和内部空间都有所改变,椎弓的闭合也存在缺陷,椎间盘不完整或者缺失。在椎骨的这些表现可以在胚胎期13.5d就可以出现。研究还将完全基因敲除小鼠的骨骼与条件基因敲除鼠的骨骼进行对比,这些结果可以使得研究者认识TGF-β不同配体在不同细胞内的信号转导作用。
以上只是简单介绍了近两年利用条件基因敲除技术制备疾病模型的情况。目前,动物模型模拟人类疾病研究还处在单个基因功能变化引起疾病的水平,而大部分人类疾病属于多基因疾病,因此,动物模型的研究方向是那些复杂的人类疾病。但是,研究单个基因突变、错误表达与表型的关系仍然是未来工作的基础,科学工作者仍需扎扎实实地进行长期广泛的研究,从而最终认识人类遗传疾病的复杂本质。
(五)Smads基因敲除与内耳发育
Smads基因是哺乳动物体内转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号转导途径中一个重要的新基因家族。TGF-β细胞素超家族由TGF-β、活动素(activins)、抑制素(inhibins)、骨形态形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等分泌型的多肽信号分子构成。TGF-β信号分子通过调节细胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡而在生物整体及各种器官的发育过程中起重要的作用。Smads是细胞质内TGF-β信号转导分子,它们可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导入细胞核内。由于TGF-β是一种自分泌或旁分泌的、可抑制上皮细胞和淋巴细胞等多种细胞周期的细胞因子,在TGF-β信号通路中的任何一个环节中分子发生特异性的遗传突变都可能提供一种选择上的优势使得细胞逃脱TGF-β介导的生长控制。因此,Smads基因家族的多个成员均被认为是可能的肿瘤抑制基因。Smads基因的缺失和突变已经在多种人类肿瘤中发现。
Smads家族目前有9个成员,分成受体激活型、通用型和抑制型三类。不同的成员在信号转导过程中起不同的作用。受体激活型也称受体调节型Smads,包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5及可能的Smad8,它们可与Ⅰ型受体直接作用并被磷酸化。通用型Smads目前只发现Smad4,它与其他Smads家族成员的同源性较低,不能与TGF-βⅠ型受体结合,也不能被磷酸化,但它可与Smad家族的其他成员相互作用并形成稳定的异源三聚体,而这种异源三聚体是TGF-β信号转导所必需的。Smad6和Smad7属于抑制型的Smads,因为它们可通过竞争性地与Ⅰ型受体结合而抑制其他受体激活的Smads的磷酸化作用,从而阻断TGF-β超家族中多种成员的信号转导。Smads基因在脊椎动物发育中的功能,对于了解它们所介导的TGF-β信号在多种人类疾病中的可能作用有重要的意义。军事医学科学院基因工程研究所杨晓研究员用基因打靶技术研究Smads基因的功能已经取得了大量研究成果,并独立研制基因剔除小鼠和基因敲入小鼠模型,包括Smad3,Smad4,Smad5完全基因敲除小鼠和Smad4条件基因敲除小鼠。
目前关于Smads基因在哺乳动物发育过程中的研究已有大量令人振奋的结果,但是Smads基因在内耳发育过程中发挥何种作用人类了解甚少。
杨仕明等对Smad5完全基因敲除的杂合型成年小鼠听功能表型分析发现,与野生型小鼠相比,双盲测听检查发现突变鼠听力明显下降。并且这种听力下降程度和年龄呈现明显相关性。进一步的形态学研究显示内耳听觉器官包括内、外毛细胞,支持细胞和螺旋神经节细胞等出现不同程度的损害,尤其是以螺旋神经节细胞的退行性病变为主。利用细胞凋亡检测发现,螺旋神经节细胞和内、外毛细胞均存在细胞凋亡现象。随着年龄增长,内耳中凋亡细胞增多。这个现象说明Smad5单倍体缺失诱发小鼠模型出现内耳细胞凋亡,导致听觉细胞的退行性病变,进而影响正常听功能。这些研究证实了Smad5基因是耳聋相关基因,Smad5单倍体缺失小鼠是个理想的老年性耳聋动物模型。
作为激活型的信号分子Smad5可以引起如此的表型异常,使得我们对作为共用型的Smad4基因也产生了更多的期待。但是由于应用完全基因敲除Smad4导致小鼠在胚胎发育早期(E6.5)死亡,我们无法对该基因纯合型动物个体进行表型分析。而完全基因敲除后的单倍体虽然可以存活下来,但是表型不稳定使得其不能成为理想的基因功能研究对象。Smad4条件基因敲除小鼠可以很好地解决这个问题。
杨晓等利用Cre-lox P系统实现了软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠模型。这种小鼠模型性状稳定,基因型可靠,是一种理想的基因功能研究对象。我们利用这种小鼠模型研究发现,软骨细胞特异性Smad4基因剔除后小鼠模型出现重度的感音神经性聋。这种现象还尚未见文献报道,这为我们对Smad4基因在内耳发育方面的研究提供了很好的平台。
Smad4条件基因敲除纯合型小鼠与野生型小鼠相比,首先耳蜗大体发育呈现体积小、有明显骨性畸形。进一步的多种内耳形态学观察发现,纯合型小鼠的内、外毛细胞纤毛发育缺陷;螺旋神经节形态异常;内、外毛细胞下神经突触空泡化病变;内、外毛细胞末梢支配的神经纤维数量减少;外毛细胞下神经突触数量减少,形态异常。这些病理变化均为Smad4条件基因敲除后所引起的。证实了Smad4基因是内耳发育过程中的重要基因,它的缺陷可以导致动物个体严重的听功能障碍。软骨细胞的Smad4敲除可以导致内耳上皮的发育异常,在动物模型上证明了胚胎发育过程中耳蜗周围间充质与内耳上皮间信号相互作用机制的存在。这些结果拉开了Smads基因作用于内耳发育研究的序幕(见书末彩图28-3)。
(侯昭晖 杨仕明)
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