毛细胞再生与聋病基因治疗进展

耳聋是导致言语交流障碍的常见疾病，是人类最大的苦难之一。全世界现有7亿多人患有中度以上（55dB）听力损失。在我国，听力语言残疾性疾病一直是影响人们生活质量和生活水平的主要因素之一。据我国残疾人联合会于2006年进行第2次的全国残疾人抽样调查统计数据显示，我国现有听力语言残疾者2　780万，其中感音神经性聋占重度耳聋中的绝大部分。

在听觉系统中，毛细胞作为耳蜗感觉器官的终末感受器细胞，可以将声音刺激转换成电信号，并通过听觉神经传导至中枢，产生听觉。过度声刺激、老化、耳毒性药物、感染及自身免疫性疾病等多种因素均可引发耳蜗毛细胞和听觉神经元的不可逆性损伤，从而导致永久性的感音神经性聋。长期以来对于耳蜗毛细胞和听觉神经元损伤导致的感音神经性耳聋还没有根本有效的治疗方法。虽然使用助听器和人工耳蜗植入可以帮助耳聋患者恢复一定的听力，但费用昂贵，而且其效果仍然不尽如人意。感音神经性聋的终极治疗方法，是毛细胞的再生。

50　多年来，科学家们一直在努力探索损伤后神经再生问题，耳蜗毛细胞的再生一直备受关注。众所周知，哺乳动物和人类的耳蜗毛细胞不能再生，一旦实现毛细胞再生，将从根本上改变感音神经性耳聋无法根治的局面。为了这个梦想，国内外研究者们做了大量的探索并且一步步取得重要突破。总体而言，对内耳毛细胞的再生研究分为3个阶段。

（一）第1阶段——毛细胞再生研究

从20世纪80年代到90年代初。从人们认为毛细胞不能再生到发现鸟类和低等脊椎动物毛细胞损伤后可以自发性修复或再生。此后，毛细胞损伤后出现修复或再生得到更多的研究证实。而对毛细胞的再生研究，国内学者也作了重要贡献。

（二）第2阶段——内耳毛细胞再生研究

20世纪90年代中到90年代末。从非哺乳动物前庭毛细胞再生到哺乳动物胚胎期或发育早期听毛细胞有可能再生，这个阶段的主要成绩是毛细胞发育和分化的调控因子的发现。研究表明，许多细胞因子对毛细胞再生有促进作用，如表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGFs）等。其中，bFGF是研究最多的一种生长因子。bFGF具有广泛的生物学作用，对体外培养的胚胎神经细胞有促生长、分化的作用。研究发现毛细胞损伤后，支持细胞FGF受体（FGFR）表达水平增高，处于待增殖状态。细胞外bFGF可以与支持细胞表面FGFR结合并激活FGFR，将促细胞增殖的信息传递到细胞内，细胞内信号激活，使聚集在细胞核内的bFGF刺激核糖体基因转录，从而导致细胞增殖。Montcouquiol等用弗司扣林激活腺苷环化酶，使cAMP含量增加，激活cAMP信号转导途径，促进细胞进入细胞分裂周期。同时，这一反应还可被rhGGF2增强。此外，rhGGF2还可激活PI3－K、PCK，促进细胞有丝分裂，诱导毛细胞的再生。另外有研究证明bFGF参与毛细胞再生的始动机制。Zheng（1997）观察30种生长因子对培养中的椭圆囊上皮细胞的可能作用，证实bFGF是最有效的促细胞分裂剂，与哺乳动物内耳支持细胞的增殖有关，在毛细胞发育和再生过程中调节其增殖过程。近年来，随着对毛细胞分化过程的认识逐渐深入，研究者们开始寻找那些能够控制毛细胞分化的基因。最令人振奋的是Math1基因的发现。Math1基因是果蝇Atonal基因的鼠类同源基因，是一种“碱性螺旋－环－螺旋”基因转录调控因子，是毛细胞分化的正相调控因子，Hes－1基因则为负相调控因子。当Math1基因被敲除后，毛细胞分化被完全阻断。

（三）第3阶段——内耳毛细胞再生研究

21世纪初至今，成年哺乳动物耳蜗毛细胞的再生成为可能。通过外源性基因的诱导、促分化作用使成年哺乳动物内耳毛细胞再生的研究和应用，彻底改变了成年哺乳动物内耳毛细胞不能再生的传统观念。这一阶段研究主要集中在新生毛细胞的来源问题和寻找可能成为新生毛细胞的包括干细胞在内的前体细胞。通过腺病毒载体转染Math1基因至成熟豚鼠耳蜗的内淋巴囊，构建Math1在耳蜗非感觉细胞的过表达模型。结果显示Corti器、内沟细胞以及Hensen细胞区域产生了不成熟毛细胞，并且听觉神经轴突伸向一部分的新生毛细胞，这提示新生毛细胞吸引了听觉神经元。因此，成熟耳蜗的非感觉细胞有形成新生毛细胞的能力，Math1足以引导非感觉细胞分化成毛细胞。2000年Zheng and　Gao发现将Math1基因在新生大鼠的内耳过表达后，可以在感觉上皮外的大上皮嵴区域产生异位的毛细胞，扫描电镜下可以观察到其顶部有不成熟的纤毛。2003年Kawamoto和Raphael等将Math1基因导入成熟豚鼠内耳过表达后，同样在大上皮嵴区域观察到新生的毛细胞，同时发现在新生毛细胞诱导下，有神经纤维向其底部生长，但未观察到突触形成。White等最新报道在纯化的支持细胞培养中，有新生的毛细胞出现，而且新生毛细胞是通过有丝分裂及非有丝分裂两种方式产生的。研究显示Hensen及Claudiu细胞和内沟细胞很可能是将来在成年耳蜗中转化为新生毛细胞的靶细胞。对哺乳动物耳发育过程中感觉神经细胞形成的研究，发现耳蜗毛细胞和支持细胞拥有共同的前体细胞。

以上研究主要集中在离体培养和新生毛细胞形态研究，虽然前体细胞和毛细胞发育调控研究仍在继续，但更为关键的是，这些新生毛细胞是否具有功能，从而真正实现听觉恢复的可能性。2005年美国密歇根大学Rapheal研究小组在Nature Medicine上报道了氨基糖苷类抗生素导致全聋的成年豚鼠内耳过表达Math1后毛细胞可以再生，并伴有听功能的部分恢复。可以认为，从实现毛细胞的再生到听功能的恢复是未来研究的重要方向，这将成为毛细胞再生研究又一新的阶段。

解放军耳鼻咽喉研究所对听觉生理及聋病进行了长期的系统研究而且在毛细胞再生研究方面也已有相当的积累。令人振奋的是，我们的最新研究结果发现经圆窗膜以重组腺病毒为载体成功将Math1基因导入爆震性聋后豚鼠内耳，发现基因转导后一个月部分豚鼠听力开始恢复，2个月听力则有更好的改善。这个结果与密执安大学研究结果有部分类似之处，但他们的动物模型是药物性聋，而我们则在噪声性聋的豚鼠中用更简捷的方式经完整的圆窗膜途径，成功将Math1基因经重组腺病毒载体转染到内耳，并且实现了听觉的恢复。但毛细胞的再生是否就等同于听力完全恢复呢？哺乳动物耳蜗毛细胞分为内毛细胞和外毛细胞，他们与传入、传出神经有着复杂的突触连接。另外，耳蜗是一个特殊的器官，毛细胞会合成某些营养因子如脑源性神经营养因子（BNDF），神经营养素－3（NT－3）逆行输送到内耳的螺旋神经节细胞起营养作用，同时，支配耳蜗毛细胞的神经细胞也合成某些营养因子顺行输送到Corti器而对毛细胞起营养作用。因此，毛细胞的损伤修复或再生与听觉神经元损伤的再生是相辅相成的。再生的毛细胞能否与神经形成新的突触连接，如何连接？能否促进螺旋神经节细胞变性恢复或神经再生？机制如何？虽然体外实验观察到再生毛细胞对神经有诱导生长作用，但尚缺乏在体实验的证据；再生的毛细胞是否具有内、外毛细胞的特性，有无外毛细胞特有的电致运动；不同原因致聋后，毛细胞再生及神经再生修复的过程、机制是否相同，又各具有什么特点等，这一系列问题均有待解决。