听觉损伤后的基因治疗

（一）听觉损伤后耳蜗病理状态

为了进一步解决这些问题，我们建立了不同的耳聋动物模型，全面了解听觉损伤后病理状态，目的在于找到内耳分子干预－基因治疗的时间窗。我们的研究表明噪声、耳毒性药物及衰老因素均可引起耳蜗毛细胞不同程度损伤而造成听力下降。听觉损伤后耳蜗病理分为四个阶段（见书末彩图28－4）。

1．第1阶段　是毛细胞纤毛的损伤，作为Corti器轻度损伤的指标，这个阶段毛细胞依然存活并且具有正常的电生理特性，如果没有干预其维持时间有限，可能在5～7d，进入下一段的病理状态。

2．第2阶段　为外毛细胞和内毛细胞损伤，但支持细胞和神经纤维以及螺旋神经节细胞损伤很轻，细胞构架基本存在，但如果没有干预其维持时间可能在7～10d，否则可能又进入下一段病理状态。

3．第3阶段　为外毛细胞和内毛细胞严重损伤，支持细胞和神经纤维以及螺旋神经节细胞也有明显损伤，细胞构架难以存在。但如果没有干预将不可避免地进入最后的病理状态。

4．第4阶段　为外毛细胞和内毛细胞，支持细胞严重损伤并且基本消失，神经纤维以及螺旋神经节细胞也可能严重损伤，Corti器完全失去构架，仅仅残留上皮质或瘢痕化。

听觉损伤后耳蜗病理变化呈瀑布效应，不同程度的损伤和不同类型的损伤导致的病理形态状态可能不同，与听觉功能可能非同步表现，在第1阶段就有可能听觉功能上完全丧失，这对我们有重要提示，只有抓住时机进行干预治疗才有可能实现毛细胞的恢复和再生，才能保存听力。

（二）听觉损伤后毛细胞再生和基因治疗的基本策略

鉴于以上的研究结果，我们提出听觉损伤后毛细胞再生和基因治疗的基本策略：听觉损伤第1阶段是基因治疗的最好时机，是毛细胞可能通过完全修复或纤毛再生，达到功能的完全或部分恢复；第2阶段是基因治疗的最关键时机，内耳毛细胞虽有损伤但没有坏死，起码支持细胞和神经纤维基本正常，所以有恢复形态和功能的机会，这个阶段导入Math1基因可能有效；第3阶段处于毛细胞再生的抢救阶段，而且单基因导入无效，我们提出在致聋动物模型中应该探索内耳转导除了Math1基因之外联合多因子导入，更为重要的是在这个阶段应该可以进行干细胞导入，争取在Corti器细胞构架没有塌陷之前，所以这个阶段称之为细胞移植可能有效地实现听力恢复的抢救阶段。第4阶段，基因导入完全无效，即使干细胞导入也会面临困难，如何进行重塑Corti器细胞构架是巨大挑战。

对于耳聋基因治疗真正实现临床应用的可能性，还需要摸索导入耳蜗和前庭不同的途径，以便找到最有效简便的外源基因内耳导入方式。我们已经探索出小鼠耳后入路圆窗膜显微注射的新途径，豚鼠完整圆窗膜途径及鼓阶打孔途径。在这些途径中，完整圆窗膜途径因其对耳蜗的损伤极小，在临床应用方面具有更好的发展前景。

毛细胞再生是聋病基因治疗的最关键目标，而要实现其临床应用则需要研发具有临床应用前景的产品——高效安全可靠的基因载体。基因的输送通常需要载体来完成，目前常用的基因转染载体主要有病毒和脂质体两类。病毒－基因治疗系统表达水平高，但没有特异选择性，不良反应较多，如致癌性、体内野生型病毒生成、细胞病理改变等问题尚有质疑。脂质体能运载更多数量的基因，但脂质体－基因体系不稳定，组织特异性较差。近年来，以非病毒材料为基因载体的基因治疗研究引起重视，其中用阳离子聚合物和基因复合形成的纳米粒，模拟病毒的结构作为基因载体就是其中一个重要方面。聚合物纳米粒用于基因载体进行基因转导具有一些显著的优点，如聚合物纳米粒无毒、无抗原性、有生物相容性、控释作用（可延长基因表达时间），纳米粒具有小的尺寸、特别高的表面能，具有这些特性的纳米粒可以进入细胞，如果所用纳米粒具有与核酸分子的亲和性，同时能够进入细胞，则此纳米粒有可能成为基因载体，帮助实现基因转导；纳米粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；同时，纳米粒具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的核苷酸浓度，提高转导效率和转导产物的生物利用度；代谢产物少，不良反应少，无免疫排斥反应等。所以近年来聚合物纳米粒子作为基因输送载体的报道较多。

甲壳素（chitin）是地球上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物，壳聚糖（chitosan）为甲壳素的脱乙酰化产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖，因为壳聚糖具有良好的生物相容性，在体内能被溶菌酶等降解并代谢，且分解产物对人体无毒。它广泛地被用作药物载体和生物材料。壳聚糖与DNA间通过静电作用等而结合，一方面能增加DNA的稳定性，另一方面，壳聚糖还在增强与细胞膜的作用及保护DNA不被溶酶体降解等方面起着重要作用。壳聚糖作为基因载体材料制备比较方便，为了更好地提高转染率，需要开发出壳聚糖/基因纳米粒子。壳聚糖/基因纳米粒子可以保护部分目的基因不被核酸酶降解，并可通过内吞作用进入靶细胞。我们已经成功应用壳聚糖及其修饰物作为Math1基因纳米传递系统载体，以便最终应用于临床治疗耳聋。

我们认为，未来的研究应该通过向致聋动物模型（噪声性聋、药物性聋、老年性聋）转导Math1基因或联合多因子导入，进一步筛选促使成年哺乳动物听觉损伤致聋后恢复的有效基因；深入研究在体耳蜗毛细胞损伤后再生的过程和机制，进一步研究毛细胞再生后与神经建立连接的过程和机制，发现新生毛细胞的来源；加强和推进内耳干细胞移植和干细胞基因治疗的研究；进一步进行研发感音神经性聋基因治疗高效安全可靠的基因载体产品。