快速分离培养系统与快速药敏实验

一、BACTEC 960系统

（一）检测原理

BACTEC 960系统是集分枝杆菌快速生长培养、检测及药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。该仪器容量为960孔、平均分布于3个相对独立的培养箱，每个培养箱可垂直放置320个内置荧光晃显示剂的MGIT分枝杆菌生长指示培养管。通过连续检测接种标本的培养管所显示的荧光强度的变化从而判断是否有分枝杆菌生长。

若接种的MGIT培养管中有分枝杆菌生长，管中的营养成分和氧气将不断地被消耗，MGIT培养管中的荧光显示剂将随着管内氧气浓度的变化而发生反应。一旦培养管内氧气被利用，管内荧光指示剂将在特定光源的激活下释放荧光。BACTEC MGIT960荧光强度记忆探测器将每隔60分钟连续测定培管内荧光强度，从而判断管内分枝杆菌生长情况。

临床患者分枝杆菌待检标本（除血标本外）在必要的情况下需要经过标准的接种前处理（如标本消化及污染菌去除）。将0．5ml标本接种于事先准备好的MGIT培养管中进行培养。

当MGIT培养管被仪器判断为分枝杆菌培养阳性时，培养仪将报警，前上方的阳性指器将呈红色，同时该标本所在位置将在液晶显示屏的阳性位置上得到显示。阳性MGIT培养管可取出后直接涂片进行抗酸染色以确定是否为AFB、并可立即分离分枝杆菌菌种，制备菌悬液，第二次接种于预先配制好的含有药物敏感实验所需标准浓度药物的 MGIT培养管（含OADC）及空白对照MGIT（含OADC）培养管，然后置入BACTEC MGIT 960培养仪中同时进行培养，根据分枝杆菌的生长情况对比而判断该药物敏感性。根据PNB及TCH的药敏实验结果可进行分枝杆菌菌种初步鉴定。

（二）试剂

1．BBL MGIT分枝杆菌生长指示培养瓶 含7ml改良7H9培养肉汤，110μl包被于树脂上的荧光显示剂、10%二氧化碳。

2．BBL MGIT OADC营养添加剂

（1）油酸：可被分枝杆菌分解利用长链脂肪酸是分枝杆菌新陈代谢过程中的基础营养物质。

（2）牛血清白蛋白：结合分枝杆菌生长阻滞物（如游离脂肪酸等），保护分枝杆菌，促进其生长。

（3）右旋葡萄糖：分枝杆菌能量来源。

（4）触媒：分解培养基中可能出现的不利于分枝杆菌生长的过氧化物。

3．BBL PANTA杂菌抑制药 为5种抗菌药物的混合物，可有效地抑制或杀灭分枝杆菌培养物中的污染杂菌，在提高分枝杆菌培养阳性率的同时避免假阳性率，包括多黏菌素B、两性霉素B、萘啶酸、甲氧苄啶和阿洛西林。

4．MGIT管 可室温存放，不可冷冻，肉眼观察管内肉汤培养基应无色透明。如培养管出现浑浊现象，不可使用。使用前应检查管外标记和有效期，置37℃温育条件下培养，最长培养时间为8周。

5．MGIT OADC营养添加剂 可于4℃冰箱保存，避免冰冻或过热。营养添加剂打开后应尽快用完，尽量避光保存。

6．MGIT PANTA抗生素混合物冻干制剂 可于4℃冰箱保存，溶解后可保存72h，如在－20℃条件可存放6个月，建议溶解后立即使用。

（三）MGIT管的接种

1．在MGIT管标签上直接标记。

2．旋开MGIT管盖，在无菌条件下用滴管加入0．5ml的MGIT OADC营养添加剂。3．无菌条件下加入0．1ml的MGIT PANTA抗生素混合剂溶液。

4．加入0．5ml处理好的标本。注意，标本量超过0．5ml会增加污染机会。5．旋紧管盖、适当混匀。

6．将MGIT培养置入BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养仪孵育培养。

7．BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分枝杆菌生长情况。

（四）药敏实验

1．试剂及制备方法 MGIT AST SIRE药敏试剂盒为冻干试剂，于2～8℃保存，溶解后可于－70℃保存6个月。建议溶解后立即使用。

（1）试剂

链霉素（SM）　　 160μg

异烟肼（INH）　　 20μg

利福平（RFP）　　200μg

乙胺丁醇（EMB）　700μg

（2）制备方法：分别在每一抗菌药物试剂瓶内加入4ml灭菌蒸馏水或去离子水后混匀，得到以下各试剂浓度。

链霉素（SM）　　　　40μg／ml

异烟肼（INH）　　　　5μg／ml

利福平（RFP）　　　　50μg／ml

乙胺丁醇（EMB）　　 175μg／ml

2．阳性MGIT管的制备 MGIT阳性管1～3d的阳性培养物。如阳性管超过4d阳性的培养物则需立即转种。振荡MGIT管10s。

取1ml均匀培养物用4ml生理盐水稀释（1∶5稀释）。

3．阳性对照管制备

（1）取未接种的MGIT培养管并除去管内肉汤。

（2）将该空培养管标记为阳性对照管并标记配制日期。

（3）配制0．4%亚硫酸钠溶液（0．4g亚硫酸钠溶于100ml无菌蒸馏水或去离子水中）。

（4）将5ml亚硫酸钠溶液加入管中，将盖旋紧。使用前至少应在室温放置1h。

（5）阳性对照管能多次使用（若室温保存可使用4周）。

4．药敏实验操作步骤

（1）将MGIT管分别标记生长对照（GC），链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇等。

（2）每管中分别加入0．5ml的MGIT OADC营养添加剂。

（3）每管中分别加入对应量的已稀释的链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇等。药物终浓度见表2－6。

表2－6 药物终浓度

（4）分别在5管中加入0．5ml的1∶5稀释的阳性培养菌液。

（5）BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪孵育。

（6）取0．1ml的1∶5稀释的阳性培养菌液接种一血平板，装入一塑料袋中于35～37℃孵育。

（7）48h后检查该血平板是否有其他杂菌生长。

（8）如血平板未见有杂菌生长则可以读取BACTEC MGIT 960结果。

（9）如血平板有杂菌生长则需重复实验步骤。

5．判读MGIT管

（1）MGIT GC生长对照管和阳性对照管应为阳性，阴性管为阴性。

（2）当GC生长对照管为阳性时则开始判读药敏管，并且连续判读后续2d的结果。

（3）耐药：药敏管和GC管在同一天被判读仪判断为结果阳性，或比GC管晚1～2d。

（4）敏感：药敏管在GC出现阳性后2d内仍未生长则为敏感。

（五）TC与NTM鉴定法

1．凡制备做分枝杆菌药敏实验的实验室均需进行分枝杆菌菌种鉴定。

（1）对硝基苯甲酸（PNB）培养基：对硝基苯甲酸用二甲基甲酰胺或丙二醇溶解稀释后加入BBL MGIT分枝杆菌生长指示管中，使最终浓度为0．5mg／ml，制备方法同药敏实验培养基配制法。

（2）TCH培养基：TCH5mg溶于10ml无菌蒸馏水，取80μl加入BBL MGIT分枝杆菌生长指示培养管中，使最终浓度为5μg／ml，制备方法同药敏实验培养基配制法。

（3）接种方法：与药敏实验相同，且与药敏实验同步进行。

2．结果与报告：见表2－7。

表2－7 分枝杆菌菌种初步鉴定

二、BacT／ALERT 3D系统

（一）检测原理

BacT／ALERT 3D系统是集分枝杆菌快速生长培养、检测及药敏测定技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。采用培养全封闭式的比色法原理，通过连续检测接种标本的培养瓶中二氧化碳水平及其变化从而判断是否有分枝杆菌生长。该方法是将有染色硅树脂的特殊颜色感受物质包被于Middle brook 7H9培养基培养瓶底部，制成固相颜色感应器，通过感应器来直接感应培养管内的二氧化碳浓度变化。颜色感应器对溶解在培养基中的二氧化碳的变化非常敏感，如果标本中存在结核分枝杆菌，在培养基中生长代谢时会产生二氧化碳，并溶解在培养基中，随着二氧化碳浓度的增加，培养基的pH降低，导致每个培养瓶底部的颜色感应器发生不可逆的颜色改变，即由蓝绿色变为黄色。其过程由一个置于检测组件内部的光反射检测计进行连续检测，并通过微机数据处理得出微生物生长曲线。仪器中每个培养瓶孔位都有一个发光二极管（LED），每10分钟将光线投射到颜色感应器上，再由一个光电探测器测量反射光。产生的二氧化碳越多，则被反射的光就越多。将产生二氧化碳的量值与培养瓶中初始的二氧化碳水平相比较，根据产生的微量二氧化碳的量或二氧化碳缓慢的持续变化，判断培养结果是否为阳性。经过规定的时间后二氧化碳水平没有明显变化，标本就被确定为结核分枝杆菌培养阴性。也可于培养瓶中加入一定浓度的某种结核药物，培养3～8d后，若颜色变黄，表明有结核分枝杆菌生长，对该药物耐药，若颜色不变，表明结核分枝杆菌生长受抑制，对该药物敏感。系统可自动传输、分析并打印出药敏结果。

（二）培养操作步骤

1．去污染消化处理，确认50ml离心管中标本量不超出10ml。加入等量N－乙酰－L半胱氨酸，4%氢氧化钠溶液，振荡离心管20s，不超过30s，置离心管于室温15min。

2．加入无菌pH 6．8磷酸盐缓冲溶液，稀释标本至50ml以停止除菌作用。倒置或振荡封盖离心瓶，充分混合液体，确保所有内壁均经过浸泡，经3 000g离心15min。

3．弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲溶液复溶离心沉淀物备用。

4．取出1瓶抗生素补充试剂盒中的抗生素冻干粉和1瓶复溶液，将10ml复溶液加入抗生素冻干粉中，轻轻混匀，充分溶解。

5．准备结核分枝杆菌痰标本培养瓶（BacT／ALERT MP bottle），在瓶上标记好标本号，用医用酒精棉球消毒瓶盖，用无菌注射器在每个培养瓶中加入0．5ml已溶解的抗生素补充试剂。

6．在生物安全柜中加入0．5ml已液化去污染的痰标本于MP培养瓶中。

7．按照BacT／ALERT 3D仪器操作方法，将MP培养瓶放入仪器中，并由仪器自动培养和检测。

（三）药敏实验操作步骤

1．使用5ml灭菌去离子蒸馏水分别稀释利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇药物。

2．加入0．5ml复溶的抗生素溶液至测试瓶中，加0．5ml无菌蒸馏水至直接对照瓶和比例对照瓶。加0．5ml恢复液至每个测试瓶及直接对照瓶和比例对照瓶。

3．混匀阳性BacT／ALERT MP培养瓶内的培养基，打碎肉眼可见的团块。

4．从阳性MP培养瓶中分别移液0．5ml混悬液至抗生素瓶和直接对照瓶。

5．从阳性MP培养瓶中取混悬液0．1ml，用9．9ml无菌蒸馏水稀释，充分混匀，再取0．5ml（1∶100）稀释液接种到比例对照瓶。

6．将所有药敏检测培养瓶一起放入培养仪器中。

（四）报告结果

仪器自动检测报告结果。

1．敏感 抗生素瓶阴性或者出现阳性的时间＞直接对照瓶和1∶100比例对照瓶。

2．耐药 抗生素瓶阳性的时间≥直接对照瓶，并且抗生素瓶阳性时间≤1∶100比例对照瓶。

三、MB－Bact分枝杆菌检测系统

（一）检测原理

分枝杆菌在增殖过程中消耗氧气，产生二氧化碳，专用培养瓶的底部有特殊的LED激光器及反射感应器，并有半透膜将液体培养基与感应器隔离，只容许二氧化碳通过。当培养瓶内有分枝杆菌生长时，其释放出的二氧化碳可渗透至感应器，与感应器内的水结合生成碳酸，碳酸水解产生氢离子，使pH改变，感应器探测板的颜色也随之改变，仪器每10分钟探测一次这种颜色变化，将测得值换算成生长指数，自动连续记录并绘制成曲线图，由电脑分析并判断阴阳性，即时发出警报。

（二）仪器组成

1．孵育箱 一个孵育箱分上下两格，每格可同时放60个培养瓶，上层用于分枝杆菌培养，下层用于其他细菌培养。

2．培养瓶 有2种，一种是专门用于血液、骨髓和脊髓液标本的培养瓶，另一种是用于其他标本的培养瓶。主要培养基成分是Middle brook 7H9和促生长因子等。

3．抗生素干粉及其溶解液 干粉中含有6种抗生素，即两性霉素B、阿洛西林、萘啶酸、多黏菌素B、万古霉素和甲氧苄啶。溶解液中含有油酸和酸性红染料等。

4．营养添加剂 对于血液、骨髓、脊髓液标本，需添加小牛血清、NaCl、油酸、皂素等。

（三）培养方法

1．标本前处理 含杂菌的标本，用半胱氨酸－NaOH或5%草酸消化、去污染，离心浓集。血液、骨髓、脊髓液无需前处理，直接接种。其他无菌体液无需前处理，但接种前应离心浓缩。

2．接种 将前处理后的标本0．5ml接种到培养瓶内，加入溶解的抗生素0．5ml。血液、骨髓、骨髓液需5ml，再加入营养液1ml。放入仪器内培养，42d没有报阳性即可报告阴性。

（四）鉴定

抽取阳性瓶内菌液，做抗酸染色，确定只有AFB后，做如下鉴定试验。

1．抽取阳性瓶内菌液，分别加0．5ml到两个新的培养瓶，分别标注“GC”（生长控制）和“对硝基苯甲酸”。然后，将0．5ml促生长剂加到GC瓶，将0．5ml对硝基苯甲酸（PNB）加到对硝基苯甲酸瓶（PNB终浓度为0．5mg／ml），放入仪器培养。

2．生长对照（“GC”）瓶阳性，48h后PNB瓶的生长指数＜0．4，为结核分枝杆菌（MTB）；＞0．4或48h后呈阳性反应，为非结核分枝杆菌（MOTT）。

四、微量肉汤稀释法快速药敏（比例法判读）

该方法根据CLSI（NCCLS）M24－A微量肉汤稀释法（microbroth dilution method）原理改进，实验设计了绝对浓度法和比例法两种方法确定MIC范围，绝对浓度法是接种同样的菌量，根据含药孔与GC孔生长后菌量的比值判读结果，本方法中的比例法是预先接种不同比例的菌量，只要比较含药孔与接种1／10或1／100菌量参照孔生长后的菌量即可判别（与1／10、1／100比较判断MIC），结果判断简单，适用于结核分枝杆菌药物敏感性及MIC快速测定，包括SM、INH、RFP、EMB、TH1314等除PZA以外的所有感兴趣的药物，药物及药物浓度可自行设计，7～10d获得可靠数据，该方法效率最高，获得药敏信息量最多，能显著降低实验人员的劳动强度。

（一）原理

将药物（包括菌群分类药物）事先包被在U－底板上，将对数期菌研磨比浊，以培养基稀释后加入对照孔（GC）、含药测试孔（100%菌量，2×10－3 mg），除接种对照孔，另外接种10%（2× 10－4 mg）或1%菌量（2×10－5 mg）的参照孔，结果根据含药孔的生长情况与接种10%或1%菌量参照孔生长结果比较进行判断，在获得MIC界值范围的同时据MIC判断各药物的敏感性。

（二）方法

1．菌悬液制备 将培养后的菌株以生理盐水或PBS磨菌比浊至1麦氏单位（1McFarland＝1mg／ml）。

2．加样

（1）阴性对照孔、参照孔加培养液：从通用增菌培养基瓶中依次吸取200μl液体加入ABCD的第1列孔中（A1、B1、D1、E1）。

（2）菌悬液稀释：吸取100μl 1mg／ml菌液加入到10ml通用增菌培养基瓶中（菌浓度1× 10－2 mg／ml），混匀。

（3）参照孔加样：从已加菌的通用增菌培养基瓶中吸取20μl加入孔A1（1／10参照，菌量2×10－4 mg），吹打后吸取20μl加入孔B1（1／100参照，菌量2×10－5 mg）。

（4）含药孔加样：从已加菌的通用增菌培养基瓶中依次取200μl（菌量2×10－3 mg）加入其余各孔（ABCD的2～12列孔）。

（5）盖上盖，以1cm宽的透明胶带沿周边密封，在微孔板盖子朝上一面的右侧每4排以记号笔标记样品编号、名称，置能密封的保湿盒中。

3．培养、观察 将密封后的保湿盒置37℃孵箱培养，3～14d内，板上覆盖随盒膜片，置反射镜上观察结果。快速生长分枝杆菌一般需要3d，慢生长分枝杆菌需要5～12d。

（三）结果判断

判读时间以NC孔无生长、GC孔正常生长、1／10参照（Ref）孔已生长为准。

1．菌群鉴别 根据GC、TCH、PNB三孔的生长结果及菌生长快慢，对照表2－8判断。

表2－8 结果判断

2．药敏结果判定 将含药孔与GC、参照孔比较后判读，一般以1／10Ref作为参照，若1／10Ref菌量大以1／100Ref为参照（表2－9）。

（1）敏感（S）：低浓度药物孔不生长或生长菌量＜1／10Ref孔（或菌量远小于GC孔）判断对该药敏感。

（2）中介（I）：低浓度药物孔生长（或菌量＞1／10Ref孔），高浓度孔不生长（或菌量＜1／10Ref孔）判为中介。

（3）耐药（R）：高、低浓度药物孔均生长（菌量＞1／10Ref孔）判为耐药（R）。

表2－9 药敏结果判定

（四）注意事项

菌液磨菌要均匀，浓度必须控制在美国临床试验室标准化协会（CLSI）要求的最低抑菌浓度（MIC）测定范围。

（五）应用评价

该方法简便、快速、低成本、不需要昂贵仪器、是一种稳定实用的新技术。但对培养基的要求较高，目前只有少数公司的增菌培养基能满足这一要求。

五、浓度梯度（E－test）法分枝杆菌药敏实验

（一）检测原理及实验方法

E－test实际上是一种改良的琼脂扩散实验，该方法所测的MICs准确性极高。其原理是先将药物按log2梯度稀释成不同浓度，并用特殊技术固定于特制的5mm×50mm的塑料条上，塑料条反面标记相应药物浓度数字。实验时刮取L－J培养基上3～4周龄菌，用7H9肉汤制成McFarland 3．0菌悬液，或将肉汤培养基接种物调整浓度至McFarland 3．0浊度，用棉拭子密涂整个Middle brook 7H11琼脂＋OADC（10%油酸－白蛋白－葡萄糖复合物）培养基表面，置37℃5%～10%CO2环境预培养24h后，将E－test药条贴于琼脂板表面，药物能迅速在琼脂中扩散，并在较长时间内保持稳定而连续的抗生素浓度梯度，这样再经一段5～10d孵育，即可在药条周围形成一个圆形或椭圆形的抑菌圈，其边缘于药条的切点处即为该药物对该菌的MIC。

另外，由于塑料条上的药物能在接触琼脂培养基后很短时间内迅速扩散，且浓度梯度能够保持相对稳定，就为联合药敏实验提供了可能。实验过程与上面所述的方法基本相同，只是在预孵育24h之后于琼脂表面放置含第一种药物的塑料条，静置0．5～1h，轻轻取下，再在同一位置贴上含第二种药物的药条，再按上述方法进行孵育、判读即可。

（二）研究进展

国外有E－test用于快生长分枝杆菌、慢生长分枝杆菌药敏实验的报道，以及少量用于分枝杆菌联合药敏实验的报道，国内尚未见到有关E－test用于分枝杆菌的研究报道。

（三）方法学评价

该方法是定量药敏实验，由于它使用了药物15个连续倍比稀释浓度且最大限度地降低了接种菌量对实验结果的影响，故能准确测出该药的MIC。

1．E－test是一种定量的方法，以log2为梯度，覆盖了15个连续倍比稀释浓度，药物在琼脂中能保持稳定而连续的抗生素梯度，结果更精确。

2．E－test最大限度地降低了接种量对试验结果的影响，结果更稳定。

3．操作简单，在实验室间具有很好的重复性，易于标准化。

4．5～10d就可以报告结果，具有快速的优点。

5．用于联合药敏实验、二线抗结核药及新药的敏感性测试有着很大的优势E－test法分枝杆菌药敏实验。

六、显微镜直视下药物敏感性检测技术

（一）原理

显微镜观察药物敏感性方法是通过痰液标本的液体培养，在镜下检测细菌生长特性的方法。痰标本经过处理后，用24孔细胞培养板进行液体培养，M7H9液体培养基含有OADC以及抗微生物制剂混合物PANTA。每个标本加12孔，其中4孔不加药物，其余8孔分别加入4种一线药物，每种药物两个浓度。培养一定时间后在倒置光学显微镜下观察结核分枝杆菌索状结构形成与否，有索状结构形成即为结核分枝杆菌阳性，同时加药孔中形成索状结构即为耐该药物的结核分枝杆菌。该方法的优势如下。

1．结核分枝杆菌在液体培养基中的生长速度明显快于在固体培养基中的生长速度。

2．结核分枝杆菌在液体培养基中的形态有特色且易辨认。

3．结核分枝杆菌减低硝酸盐向亚硝酸盐的转化，会引起颜色变化。

4．倒置光学显微镜较普通显微镜性能稳定。

（二）方法

1．用N－乙酰－L－半胱氨酸－氢氧化钠－枸橼酸钠消化法净化所有痰标本以去除其他细菌。

2．在24孔板的孔中加入净化的痰标本、Middle brook 7H9肉汤培养基、油酸－白蛋白－葡萄糖－过氧化氢酶及多黏菌素B－萘啶酸－甲氧苄啶。

3．部分孔中加入抗结核药物，如异烟肼、利福平等。

4．除了周末从第5～第15天，每日1次；从第16～第25天，隔日1次；从第26～第40天，每2周1次，在放大40倍的倒置光学显微镜下进行观察。在无药的对照孔中看到细菌生长，而在含药孔中无细菌生长则认为对该药敏感，每日进行药敏实验阳性的对照菌株检测。

（三）结果

有研究结果表明，显微镜直视下药物敏感性检测技术（microscopic－observation drug－susceptibility，MODS）培养、自动分枝杆菌培养和传统罗氏培养的敏感度分别为97．8%、89．0%和84．0%，差异有统计学意义。培养阳性的平均所需时间分别为7d、13d和26d，差异有统计学意义，特异度为99．6%。与标准药敏实验的一致性为利福平100%、异烟肼97%、乙胺丁醇95%、链霉素92%。

埃塞俄比亚学者Grim等也报道了对262例痰涂片阳性的患者，采用MODS检出率为96．9%（254／262），而L－J培养法检出率为94．3%（247／262）。再对L－J培养阳性的247例用MODS进行MDR－TB检测，其敏感度、特异度、准确性分别为92．0%、99．5%、98．8%，且其培养阳性时间为5～29d，中位时间为9d，96．5%的实验结果在2周内得出。Jig等报道了MODS与BACTEG960系统进行的对照研究，其阳性结果获得MODS平均为9d，BACTECMGIT960系统平均为8d；两者之间的敏感度、特异度、准确性分别为95．0%、100%、98．3%。

（四）应用评价

MODS是一种直接检测结核杆菌方法，优点能连续观察分枝杆菌生长过程，MODS对细菌学研究非常有帮助，但成为临床常规方法有一定难度。

七、微量平板alamar blue检测法

（一）原理

微量平板alamar blue检测法（microplate－based alamar blue assay，MA－BA）是运用氧化还原染料alamar blue来作为细菌生长的一种指示剂，根据颜色的变化判定结果。

（二）方法

1．标准菌株H37Rv、临床结核分枝杆菌菌株在Middle brook 7H11琼脂上继代培养。

2．悬浮液的制备。

3．在7H9GC肉汁培养基中进一步稀释悬浮液。

4．异烟肼、链霉素、乙胺丁醇药物原液在去离子水里配制，利福平在二甲亚砜里配制；原液在加入微孔板前在7H9GC肉汤培养基中进一步稀释。

5．MA－BA操作过程

（1）200μl灭菌去离子水加入已消过毒的96孔板的四周边的各孔中，以减少孵育过程中各测试孔中培养基的蒸发。

（2）3～111列的B～G行孔中加入100μl的7H9GC肉汁培养基。

（3）2～3列的B～G行孔中加入100μl的2倍药物浓度溶液。用多通道移液管把100μl溶液从第3列移至第4列，使各孔混合均匀。相同序列按1∶2稀释直至第10列，移除第10列中多余的100μl培养基。最终各药物浓度如下：异烟肼0．031～8．0μg／ml；利福平初实验浓度0．0156～4μg／ml，再实验浓度0．062～16μg／ml；链霉素0．125～32μg／ml；乙胺丁醇0．5～128μg／ml。

（4）用Eppendorf循环移液管将100μl结核分枝杆菌接种物加入2～11列的B～G行（各孔终体积为200μl）。第11列各孔作为不含药物的对照孔。

（5）孔板用石蜡密封，37℃孵育5d。

（6）将混合制备的alamar blue试剂加入B11孔。

（7）B11孔变成粉红色，再将混合试剂加到所有的孔中，微孔板用石蜡重新密封，37℃下再孵育24h，记录所有孔的颜色。

（8）蓝色被判定为没有细菌生长，粉红色为有细菌生长。

（9）MIC被定义为阻止颜色由蓝色变为粉红色的最低药物浓度。

（三）结果

Scott等报道，用两种方法对异烟肼的测定结果，BACTEC460法测定的对0．1μg／ml浓度敏感的19个菌株，MABA法测定有17株相一致，MIC≤0．25μg／ml；BACTEC460法测定为部分耐药的5个菌株中（0．1μg／ml耐药，0．4μg／ml敏感），MABA法测定有3株相一致，MIC为0．5μg／ml；用BACTEC460法测定的对0．4μg／ml浓度耐药的12株，MABA法测定100%相吻合，MIC均≥1μg／ml。对利福平的测定结果，BACTEC460法测定的对1μg／ml浓度敏感的26个菌株，MABA法测定100%相一致，MIC≤0．25μg／ml；BACTEC460法测定的对1μg／ml浓度耐药的9个菌株，MABA法测定100%相一致，MIC～16μg／ml。100%的结果获得时间为8d。有报道显示，两种方法相一致达97%，其用50℃的温度孵育，7d可得到58%的结果，孵育14d可得全部结果。

（四）应用评价

MA－BA是一种简便、快速、低成本、无放射性污染、不需要昂贵仪器、所用试剂无毒且温度稳定的实用技术。

八、硝酸还原酶测定法

硝酸还原酶测定法（nitrate reductase assay，NRA）是一种快速检测异烟肼和利福平耐药的方法。

（一）原理

结核分枝杆菌体内的硝酸还原酶能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，如果培养基内有亚硝酸盐存在，通过加入特异的试剂将出现粉红色的颜色变化，提示有结核分枝杆菌存在，肉眼将可以观察到，也可以用分光光度计进行检测。据报道，99%以上的抗酸分枝杆菌能够产生硝酸还原酶，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐。

（二）方法

1．细菌的培养和接种，在培养基中加入NaNO3。通过每日不同浓度菌液的显色实验，确定实验的菌浓度。

2．将含有NaNO3的菌悬波稀释10倍后分装至10个培养管中，37℃孵育，3d后，每2天取一管进行显色实验，确定检测时间。

3．在含有NaNO3的菌悬液中，加入需检测的不同种类、不同浓度的药物，37℃孵育，1d后，每日进行显色实验，确定含药培养管的检测时间。

4．临床标本常规处理后，进行培养，将菌悬液置入含有NaNO3的培养基中，加入检测药物，进行耐药性检测。

5．结果判读：培养基呈现桃红色为有细菌生长；培养基呈现无色，为无菌生长。

（三）结果

崔振玲等报道了用BACTEC960法检测结果为判断标准，检测INH耐药性的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及符合率分别为91．9%、98．4%、94．4%、98．4%和96．9%；检测RFP耐药性的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及符合率分别为95．5%、98．6%、91．3%、99．3%和98．1%。Martin等报道的应用汇总受试者工作特征（SROC）曲线进行荟萃分析的结果显示，NRA检测利福平耐药MTB的敏感度和特异度多数＞94%，而检测异烟肼耐药MTB的敏感度和特异度多数＞92%，两种药物的SROC曲线下面积均＞99%。提示应用固体培养基中培养出的分离株进行NRA检测，可获得较高的敏感度和特异度，直接应用痰涂片进行NRA检测则效果不太好，但如预先保证痰标本的阳性结果，也能获得较高的特异度和敏感度。

（四）应用评价

NRA是一种廉价、快速、敏感度和特异度均较高的检测耐药结核病的方法，它可直接用于检测痰标本；使用液体培养基能更快地得到结果。

九、孔雀绿微管药敏检测法

（一）原理

2007年，Parissa等报道应用孔雀绿染色剂来尝试显示痰标本中结核分枝杆菌的活性，即孔雀绿微管药敏检测法（malachite green microtube susceptibility assay，MGMT），孔雀绿染色剂是一种常规用于罗氏培养基的复合物，为呈暗绿色的三苯甲烷染料。在结核分枝杆菌代谢过程中能改变颜色，通过这种原理判断微管中有无生长结核分枝杆菌。

（二）方法

1．直接MGMT步骤 痰标本用Petroff方法（2%NaOH）分解和去污15min；痰标本以每分钟3 000转离心30min；去除上清液，留1～2ml沉淀物，剩下的沉淀物置入2ml消毒磷酸盐缓冲盐水；其中200μl的悬浮液接种到罗氏斜面培养，100μl悬浮液接种在每个含有100μl 7H9肉汤及加入药物（或未加入药物）的孔雀绿微管中。另外，每管备了3根对照管，以选择实验的时机。样本在孵育7d、14d、21d时加入50μl（浓度0．02μg／ml）的孔雀绿到对照微管中观察是否有颜色改变。如果变成无色，说明已经有足够的代谢活性可进行实验。这时在每个有药物的微管中加入孔雀绿，记录下颜色；在报告实验结果之前，在每个孔雀绿敏感实验的微管中取一些沉淀物行抗酸染色涂片。

2．间接MGMT步骤 间接孔雀绿微管敏感性实验的菌落（从罗氏培养基表面获取）被移入含有6～8个玻璃串珠的3ml 7H9GC肉汁的消毒试管中，浑浊度调整到1mg／ml标准；把悬浮液稀释成7H9肉汁。100μl的悬浮液接种于孔雀绿敏感性试管，最后敏感性试管中的分枝杆菌浓度大约是6×105CFU／ml；所有的微管都在37℃下孵育。一旦无药物试管中的颜色从暗绿色变成无色，那么在有药物试管中加入5μl（浓度为0．02μg／ml）的孔雀绿；这些试管再在37℃下孵育12～24h就可记录结果。

（三）结果

有研究者采用MGMT技术直接检测80例临床痰标本和间接检测60例MTB临床分离株的药物敏感度，结果在80例临床痰标本中有38例（47．5%）痰涂片镜检阳性，50例（62．5%）罗氏培养阳性，42例（52．5%）MGMT阳性；MGMT检测临床标本MTB的敏感度和特异度分别为84%和95．9%；42株MGMT阳性菌株中有21株为敏感株，8株为耐多药株，2株为广泛耐药株，4株为耐其他抗结核药物株；从标本接种到MGMT报告结果的平均时间为15d，而采用间接比例法平均时间为70d；MGMT法直接检测临床标本的敏感度为87%，特异度为80%；MGMT法间接检测临床分离株的敏感度为80．5%，特异度为95%。异烟肼、利福平和环丙沙星的敏感度和特异度均达到100%。链霉素、乙胺丁醇和乙硫异烟胺的特异性低于90%。

（四）应用评价

MGMT技术具有简单、快速且不需要昂贵设备等优点，适合于广大基层医院开展应用。