结核病免疫学

当年柯赫在发现结核分枝杆菌时曾指出，“细菌不是结核病的全部病因”。感染结核分枝杆菌后，宿主的最终归宿（耐受或敏感乃至发病）是结核分枝杆菌和宿主之间一系列相互斗争过程的免疫学结果。大部分感染者克服了感染，仅5%左右的感染者进入临床免疫学反应。因此，从这种意义上讲，结核病是一个T细胞介导的保护性免疫反应和病原性免疫反应调控紊乱的免疫性疾病。感染宿主显示耐受性或敏感性是由细胞与单核吞噬细胞及其细胞因子网络介导的免疫反应决定的。巨噬细胞是主要的抗原呈递细胞和效应细胞。保护性免疫是由以保护性抗原活化的Th1辅助T细胞介导的巨噬细胞非特异性抗菌活性的提高来实现的，细胞毒T细胞和溶解T细胞补充了抗菌机制。另一方面，病原性抗原活化了可能是由Th2辅助T细胞介导的以效应细胞诱导的特征性组织坏死性的结核病免疫病原学反应。因此，以灭菌为核心的保护性和以组织坏死为特征的病原性两个分离的免疫反应构成了结核病临床免疫学的实质。

一、细胞因子和T细胞

T细胞活化是结核性免疫的关键，活化的T细胞可激活巨噬细胞摆脱自然状态成为活化巨噬细胞，发挥更强的抗结核活性。活化T细胞是通过分泌细胞因子来实现其免疫反应的调控功能的。

（一）细胞因子

细胞因子是一群本质和功能各异的免疫细胞分泌的免疫活性分子，相互形成一个复杂的网络，介导和调控各种免疫反应表型。细胞因子往往具有多效性、剂量的效应双重性和网络性特性。结核免疫反应也正是通过此细胞因子网络，介导抗结核感染，调控机体保护性或导致免疫病原学反应与结核病患者的全身症状。

细胞因子可依据分泌细胞和介导的免疫效应分类。依据产生细胞，细胞因子可分为单核细胞因子和淋巴细胞因子，其中一些细胞因子两种细胞均可产生。依据功能上可分为免疫因子和趋化因子。

1．淋巴细胞因子 在结核性免疫中重要的淋巴细胞因子有多种。

（1）白细胞介素－2（IL－2）：IL－2是抗原反应特异性T细胞因子的生长因子，也是巨噬细胞活化因子，是Th1辅助T细胞的特征性细胞因子。重组IL－2可显示限制感染小鼠体内卡介苗分枝杆菌复制。

（2）白细胞介素－4（IL－4）：IL－4是Th2辅助T细胞特征性细胞因子。它和IFN－γ功能相反，通过下调IL－2受体表达和IL－2mRNA转录，抑制T细胞克隆增殖，激活巨噬细胞。因此，IL－4有着抑制抗结核感染免疫反应能力。

2．单核细胞因子 活化巨噬细胞在吞噬结核分枝杆菌过程中也产生一系列细胞因子，或调控抗菌活性，或调控巨噬细胞自身功能，或介导结核病临床症状。

（1）干扰素－γ（IFN－γ）：IFN－γ是鼠结核性免疫模型中重要的细胞因子，是Th1辅助T细胞的特征性细胞因子。巨噬细胞、活化γ细胞和白细胞均可产生IFN－γ。IFN－γ在钙代谢平衡中起着重要作用，诱导巨噬细胞成熟，通过诱导呼吸暴发提高巨噬细胞抗分枝杆菌作用。IFN－γ基因敲除小鼠，失去了保护小鼠免于亚致死剂量牛分枝杆菌气雾或静脉攻击的能力，出现播散性结核病。试管内将结核分枝杆菌感染人肺巨噬细胞，IFN－γmRNA表达水平增加，IFN－γ释放。

（2）肿瘤坏死因子－α（TNF－α）：TNF－α是一个同时对保护性和病原性免疫反应有作用的细胞因子双刃剑作用的例证。相比之下，其在病原性反应介导意义远重于其对保护性的作用。动物和试管实验表明，TNF－α促进肉芽肿形成、控制感染和菌的剔除。但过度表达时则导致病变组织坏死，是宿主自身细菌播散和进入环境传播的主要介导因子。TNF－α进入血液循环是结核病的全身症状的原因，可导致发热和体重消耗。

许多结核分枝杆菌抗原可诱导TNF－α产生。在结核性胸膜炎患者胸腔积液TNF－αmRNA和蛋白表达提高。但是，一些慢性结核病患者外周血单核细胞的释放TNF－α的能力远低于新诊断的结核病患者，可能病变局部TNF－α剂量水平更为直接调控免疫方向。

Mohan（2001）指出，TNF－α是防止其复燃所必需的因子。

（3）白细胞介素－1（IL－1）：IL－1是一内源性致热原。IL－1β有信号肽，可胞外分泌，它是结核病患者发热的可能的原因。试管内感染可诱导局部促炎性细胞因子IL－6和TNF－α，上调IL－2受体表达和IL－2产生，显示了促炎性反应。结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、20kDa和46kDa抗原可诱导IL－1。

（4）白细胞介素－8（IL－8）：IL－8是一有趋化功能的细胞因子，在介导淋巴细胞进入肉芽肿起着关键作用。过量释放导致炎性细胞渗出和肺组织坏死。

（5）白细胞介素－12（IL－12）：IL－12是一介导Th1细胞反应的单核细胞因子。在结核性胸腔积液中IL－12mRNA和蛋白富集，说明IL－12参与对结核分枝杆菌耐受性免疫反应的介导，有利于辅助前体T细胞向Th1方向分化。宿主对结核分枝杆菌的反应取决于活化T细胞的分化，而T细胞活化则受巨噬细胞因子IL－12的调控。

（6）白细胞介素－10（IL－10）：试管内结核分枝杆菌刺激人和鼠巨噬细胞分泌抗炎性分子IL－10。IL－10可抑制单核细胞细胞因子合成，下调巨噬细胞Ⅱ类主要组织亲和性复合物分子表达，抑制抗原特异性T细胞增殖，是巨噬细胞活化因子。因此，可能是免疫无反应性的原因。

（7）转化生长因子－β（TGF－β）：TGR－β抑制巨噬细胞细胞因子合成，下调Ⅱ类MHC分子表达。结核病患者局部TGF－β过量表达，可导致巨噬细胞脱活化。因此，只有当TGF－β抗体抑制TGF－β活性时，IFN－γ才能提高巨噬细胞抗分枝杆菌活性。

（二）Th1、Th2和Th0

依据对关键淋巴细胞因子和抗原呈递细胞的需要不同，可将小鼠CD4＋辅助细胞界分为Th1和Th22个淋巴细胞分泌的因子谱型。在抗感染过程中，Th1／Th2细胞一般相互呈负性相关，彼此对抗对方的表达，构成一个相互调控系统。

小鼠的Th1／Th2表型受到遗传背景的控制。在感染鸟分枝杆菌时，C57BL／10小鼠系产生明显的Th1型反应，大量的IFN－γ和IgG2a类抗体产生，但无IL－4。而BALB／c小鼠则分泌IL－4和IFN－γ，产生可识别更多抗原的IgG1和IgG2a抗体。

IFN－γ、IL－2等是Th1辅助T细胞的标记，提高巨噬细胞杀菌活性。Th2T细胞产生IL－4、IL－5、IL－6和IL－10，刺激B细胞生长和分化，放大体液免疫反应。除了特征性细胞因子外，两个类型T细胞也产生一些共同细胞因子。巨噬细胞因子IL－12有促进Th1细胞分化的作用。单核细胞因子IL－1是Th2T细胞的生长因子，而单核巨噬细胞因子IL－6和IL－10则抑制Th1T细胞表达。Fenton（1997）指出，IFN－γ可诱导IL－10产生，但也可被内源性IL－10阻断，显示出巨噬细胞活化和脱活化的自我调控。

研究发现，在小鼠实验性结核病中也存在Th1／Th2辅助T细胞的分化，但也常见Th0型细胞因子型。在实验性结核病小鼠中，Th1辅助T细胞介导保护性免疫，而Th2介导以变态反应为特点的延缓性超敏感反应性。

但是与小鼠不同，在结核病患者中有关Th1／Th2的报道存在不同的实验结果。某些作者发现，结核病患者外周血的大多数CD4＋T细胞在试管内对结核分枝杆菌的反应是Th1型的，产生高浓度IFN－γ和低浓度的IL－4，IL－5。而在结核菌素皮试部位的T细胞是Th2型的。但是，也有在试管内同时存在Th1和Th2型T细胞的报道。在结核性胸膜炎胸腔积液Th1型细胞因子IFN－γ和IL－2的表达远高于外周血的淋巴细胞，提示Th1细胞在抗结核感染耐受性免疫反应中可能起着重要作用。同时，有些作者也在结核病患者和结核菌素阳性健康者的外周血分析中发现有相似的IFN－γmRNA水平和分泌IFN－γ淋巴细胞数。与健康者相比，并未见结核病患者的外周血细胞IL－4与IL－10mRNA和蛋白分泌提高。这些观察现象的差异可能和肺结核病变的局限性与隔室化以及所用细胞和培养条件等实验条件有关。因此，结核病患者Th1／Th2细胞的存在及其在结核免疫中的作用有待进一步阐明。

Amoxa（2001）指出，IL－8在介导淋巴细胞进入结核性肉芽肿中起着关键作用。而Th2型细胞因子IL－4和IL－10可下调IL－8的表达。可见Th2型反应对结核性肉芽肿形成有着重要作用。

结核分枝杆菌感染时，树突状细胞迁移到T细胞区域呈递抗原，上调IL－12，分泌IFN－γ活化Th1T细胞。

（三）T细胞

淋巴细胞是一群形态上均一的小单核细胞。但是，在组织定位、物理性质、成熟程度、表面分化抗原和免疫功能上显示出万千差异的异质细胞群。稳定表达相同特异分化抗原的细胞集群组成淋巴细胞亚群。一些可作为分化标记的糖蛋白表型标记称为分化簇（CD）。CD2和CD3是所有成熟的人T细胞所表达的，称为共同T细胞抗原。依据CD4和CD8两个分化簇糖蛋白的表达T细胞可划分为CD4＋CD8－和CD4－CD8＋两类T细胞。

T淋巴细胞具有下列功能：①增殖功能，淋巴细胞在抗原刺激下反应性克隆增殖；②调节功能，一些淋巴细胞群通过淋巴细胞因子和直接接触可调节效应细胞功能，如辅助细胞，记忆T细胞等；③效应功能，淋巴细胞也分化成有多种效应功能的亚群，如细胞毒T细胞（Tc），延缓型变态反应T细胞（TDTH）和CD4＋溶解T细胞。

依据T细胞受体（TCR）构成，CD3T细胞有两种类型：αβT细胞和γδT细胞。

1．γδT细胞 γδT细胞的TCR由γ链和δ链组成，有两个表型，V1和V2。分枝杆菌抗原活化的γδT细胞亚群排他性表达Vγ9＋／Vδ2＋。γδT细胞仅占CD3＋T细胞很小的部分，为1%～10%，健康人平均约为6．1%。

与αβT细胞不同，γδT细胞是不表达CD4和CD8表面分化抗原的T细胞（CD4－CD8－）。新生儿中在抗原刺激前就可检测到γδT细胞，它在感染早期起着自然保护作用。ΓδT细胞无需抗原呈递细胞呈递活化，显示非MHC限制性，仅对活菌抗原应答。结核分枝杆菌H37Ra的10，14kDa蛋白可刺激人γδT细胞。结核病患者和结核菌素阳性健康者体内都可发现γδT细胞的存在。在获得性免疫阶段，γδT细胞免疫反应逐渐消退细胞发育。

活化的γδT细胞可分泌IL－2，是巨噬细胞早期活化因素之一。活化的γδT细胞也具有CD8＋T细胞相当的细胞毒性活性。但是，γδT细胞不介导延缓型变态反应。

2．αβT细胞 αβT细胞TCR由α链和β链组成，在接受MHC限制性呈递抗原后有多种表型分化，介导不同的免疫反应，是细胞免疫的核心。

（1）CD4＋辅助T细胞（Th）：CD4＋T细胞是一类细胞表面表达CD4分子的CD3＋αβT细胞，有多种表型和功能分化。参与结核病免疫的CD4＋T细胞有辅助T细胞（Th）、溶解T细胞、变态反应T细胞（TDTN）、记忆T细胞（Tm）等，它们有不同表型和不同功能，介导不同的免疫反应。辅助细胞是一群分泌IFN－γ等一系列细胞因子的免疫细胞，在抗结核感染免疫中起着关键作用。过继免疫证明，剔除CD4＋T细胞的受体小鼠在接受免疫供体小鼠CD4＋T细胞后可获得抵抗结核性攻击的能力，说明CD4＋T细胞是抗结核保护性免疫的核心。Th1／Th2辅助T细胞可能调控着结核病免疫反应方向。

（2）CD4＋溶解T细胞：参与保护性的另一个CD4＋T细胞是溶解T细胞，在分枝杆菌感染中常见此类细胞。在实验性小鼠结核病中，CD4＋T溶细胞是在感染晚期出现的细胞群，协同CD8＋细胞毒T细胞裂解细菌过载巨噬细胞，也可裂解各种滤液蛋白和活菌致敏的巨噬细胞。在结核病患者和PPD阳性健康人都发现MHCⅡ类限制性CD4＋溶解T细胞。此类细胞也可能介导感染巨噬细胞的凋亡。

（3）CD4＋变态反应T细胞（TDTN）：TDTN细胞是一寿命较长效应T细胞，参与肉芽肿形成，介导延缓型超敏感性变态反应（DTH），也有免疫记忆功能。很多实验表明，在分枝杆菌感染中Th细胞和TDTN并非同一细胞。TDTN效应细胞可过继传递受体迟发型变态反应，但不能传递保护性。最近的研究发现，IFN－γ基因敲除小鼠体内仍可检出TDTN。这表明两者保护性和迟发型变态反应是两个不同的免疫反应。

（4）记忆细胞（Tm）：Tm细胞也是一类CD4＋T细胞。Gridffin在1994年报道，小鼠静脉感染结核分枝杆菌后21dCD4＋记忆T细胞出现，表型为CD44hCD45neg，介导免疫记忆。

（5）CD8＋T细胞：CD8＋T细胞也是一异质性细胞群，参与抗结核免疫的主要有细胞毒细胞（Tc）和抑制性T细胞（Ts）两类。CD8＋T细胞是抗病毒感染的主要保护机制，也可裂解结核分枝杆菌过载巨噬细胞。因此，CD8＋T细胞补充了抗结核感染细胞免疫机制。经单克隆抗体缺失CD8＋T细胞后，小鼠实验性结核病加重。β2m微球蛋白基因敲除小鼠，MHCⅠ类分子表达受阻，CD8＋T细胞缺失，小鼠显示结核病重症化倾向，可快速死于结核分枝杆菌感染，但不死于卡介苗分枝杆菌和结核分枝杆菌无毒株感染。CD8＋T细胞虽也可过继传递抗卡介苗感染保护性，但是不能完全阻止结核分枝杆菌感染，说明CD8＋T细胞对保护性的辅助性质。但是，Rees报道在人体很少鉴定到结核分枝杆菌致敏的CD8＋T细胞。

CD8＋抑制T细胞具有抑制CD8＋T细胞过度表达的功能。

3．CD1脂类复合体特异的T细胞 CD1蛋白属MHCⅠ类样分子，由CD1a－e 5种分子组成，它可与β2m（MHCⅠ类蛋白的轻链）形成异二聚体，不具有多样性。CD1在树突状细胞（DC）中有丰富的表达，它可以特异性地识别糖脂，其处理和呈递不依赖于抗原加工相关转运体分子。但是因为它们的受体比MHCⅠ类和MHCⅡ类细胞要少得多，所以研究者们认为它是先天性免疫与获得性免疫的桥梁，提供最开始的IFN－γ，引发炎症级联反应。

（四）其他参与免疫反应细胞

一些其他细胞也参与结核性免疫反应。CD4－CD8－CD1限制性T细胞，可诱导巨噬细胞凋亡，但对菌活力无影响。簇化分子CD1可识别非蛋白类抗原，如脂质抗原。

自然杀伤细胞（NK）虽然不是自然免疫必需细胞，但与结核性免疫反应强度有关。NK细胞是IFN－γ分泌细胞，与巨噬细胞早期免疫活有关，在小鼠模型中，可促进Th1反应。树突状细胞（DC）参与抗原呈递和诱导Th1型免疫反应。

（五）巨噬细胞活化

在一非致敏状态下，巨噬细胞是以自然巨噬细胞，反应巨噬细胞状态存在的，接受T细胞活化刺激后可分化成活化态。

巨噬细胞激活需要双信号，IFN－γ启动信号和脂多糖触发信号，2个信号有协同作用。活化的巨噬细胞出现上皮细胞样改变，线粒体、溶酶体、核和核仁的形态学改变和产生呼吸暴发、氧自由基出现、细胞因子分泌。除了抗菌活性提高外，也合成和分泌很多急性反应期蛋白，血管活性肽等因子。完全活化的巨噬细胞，分泌TNF－α等细胞因子，显现抗菌性保护性免疫和组织坏死性病原性免疫功能。

一些细胞因子调控巨噬细胞抗菌活性。在小鼠体内，TNF－α有抗卡介苗分枝杆菌保护性，但是并无证据表明是在吞噬细胞水平上表达的。有报道，1，25－二羟基维生素D3和维生素A可活化巨噬细胞的抗结核分枝杆菌活性。

巨噬细胞有自我调节活化态功能，多种因子参与其调控。IFN－γ在鼠巨噬细胞活性上调中起着关键作用，活化鼠巨噬细胞，抑制结核分枝杆菌胞内增殖。但是，INF－γ活化巨噬细胞的抗菌能力因菌株而异，试管实验中可明显抑制结核分枝杆菌H37Rv的胞内生长，但Middleberg毒株则可耐受。INF－γ活化巨噬细胞是通过－95kDa膜蛋白的IFN－γ受体实现的。经酪氨酸蛋白激酶（PKT）途径，诱导巨噬细胞Ⅰa免疫抗原表达。IFN－γ可增加脂多糖诱导TNF－αmRNA表达。但是，IFN－γ也诱导部分花生四烯酸成前列腺素E2（PGE2），转而下调IFN－γ刺激，抑制Ⅰa表达，成为自分泌调控信号。前列腺素E2提高cAMP水平，抑制膜受体，黏附分子表达和吞噬，抑制免疫抗原Ⅰa的表达和NO释放。抗前列腺素药物处理，可抑制AMP水平，促进巨噬细胞NO释放。IFN－γ和脱活化因子IL－10也存在一自我调节活性。

一些感染巨噬细胞发生的凋亡现象也是一种活化态调控。

二、保护性免疫

人们一般将以抗菌为核心的免疫称为细胞介导的保护性免疫反应（CMI），而将以组织坏死为特征的免疫病原性反应称为变态反应（DTH）。初期将保护性免疫仅理解成巨噬细胞的直接杀菌作用。近年来，将由CD8＋细胞毒T细胞和CD4＋溶解T细胞裂解高菌负载的低活性巨噬细胞功能补充在保护性免疫反应中。

（一）先天性免疫和获得性免疫

1．先天性免疫 先天性免疫是指宿主在进化过程中获得的对结核分枝杆菌感染的免疫无应答性，是由遗传决定的宿主种的属性。人体对结核分枝杆菌反应属于中度敏感水平。但也存在着种族和人群中的个体反应异质性。先天性免疫反应是一非特异性免疫反应。介导自然免疫的细胞有单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和T细胞等。

小鼠自然免疫受Bcg基因调控。Gros在1981年指出，卡介苗分枝杆菌在小鼠体内增殖是受位于1号常染色体极位的一显性基因控制的，命名为Bcg基因。Bcg基因有2个等位基因，Bcgs（敏感，菌生长）和Bcgr（耐受，菌不生长）2个表型，各占50%，无中间过渡类型。后来发现，此基因是多效应的，也控制对鼠伤寒杆菌和利什曼蠕虫的自然免疫基因连锁，统称为Bcg／Lsh／Ity基因。Bcg基因可控制感染的前3周的BCG Montreai株在体内生长。

Vida（1993）将分离到Bcg基因编码的硝酸盐转运蛋白称为自然免疫相关蛋白－1（Nramp－1）。此酶是－53kDa膜结合转运蛋白，与真核细胞的硝酸盐转运酶同源，参与巨噬细胞反应氮中间产物反应。

Bcg基因介导的是一个非T细胞介导的非特异性的自然免疫反应，由抗菌能力低下的自然巨噬细胞和反应巨噬细胞等其他吞噬细胞介导，效率低于获得性免疫的活化巨噬细胞。

在小鼠中，Bcg基因并不能控制结核分枝杆菌的生长，它取决于另一个功能不清的Tbc－I基因。

人染色体2q35中存在和Nramp－1编码基因同源基因，具有4个多形态，有报道认为和非洲人群对结核病敏感性相关。

因此，原发结核性感染是一个自然免疫和获得性免疫相继介导的事件。细菌自然抗原加工和表达后，T细胞活化，获得性免疫建立。

先天性免疫和获得性免疫过程中，巨噬细胞的活化均受到遗传因素控制。不同遗传背景个体对结核分枝杆菌感染有不同的免疫反应。

2．获得性免疫 获得性免疫反应是个体在结核分枝杆菌感染后获得的，通过抗原，T细胞和巨噬细胞相继活化。在实验性结核病中，结核分枝杆菌进入肺泡后1周非活化吞噬细胞内增殖，释放的细菌被邻近吞噬细胞再度吞噬。感染后2～3周循环反复进行，感染区域非活化原发肉芽肿建立和不断扩大，细菌通过淋巴管和血脏器组织播散。在敏感的近亲系家兔实验室结核病中，前3周内细菌数可增1×104cfu，在豚鼠模型中，前2周内菌数增加到1×103 cfu时，局部获得性免疫开始建立。但此后，未免疫动物体内细菌的增殖仍在继续，而免疫动物中细菌的生长抑制，显然两者程度不同的保护性。

在气雾感染的家兔和其他动物模型中，感染后3周感染受到控制，获得性免疫建立，CD4＋辅助T细胞，CD8＋细胞毒T细胞和CD4＋溶解T细胞分化，巨噬细胞活形成上皮样细胞肉芽肿，胞内结核分枝杆菌或被杀死或以持留菌状态存留，病变内细菌逐渐减少。在获得性免疫介导下，原发综合征和转移病灶逐渐成为无菌病灶。但是在一些坏死区域可存留休眠菌群，成为继发性结核病的细菌学基础。

（二）保护性免疫（CMI）

结核分枝杆菌原发感染后，大部分感染人群可自愈。90%以上的原发感染者可健康度过一生，仅约5%的人可在其一生的某个时刻发病。即使在发病者人群中，未经任何治疗，也有50%左右的人可因保护性免疫而自愈。显然，对这些人群来说，应该存在有效的保护宿主的保护性免疫反应。20世纪20年代开始，通过T细胞缺失和过继免疫技术明确了T细胞在结核病免疫中的地位。现已明确，结核病免疫是T细胞介导的细胞免疫。这个过程包括结核分枝杆菌侵染、摄取、抗原加工和呈递、T细胞受体的信息传递、T细胞活化、细胞因子分泌和效应细胞效应功能表现等过程。T淋巴细胞在结核病免疫中起着中心作用，巨噬细胞是主要的起始和效应细胞。

一般将细胞介导的抗菌活性称为细胞介导的保护性免疫，实际上常指在感染过程建立的获得性免疫反应，而与自然耐受性相区别。获得性保护性免疫应具有3个方面保护性功能：①承接自然免疫，最终解除结核分枝杆菌的初次感染；②建立免疫记忆系统，快速应对新的感染；③免疫监视，防止潜伏性感染复燃，并在复发性感染中迅速保护宿主。

获得性保护性免疫也受到个体遗传异质性控制。在耐受性B6鼠系中，可控制肺和脾内结核分枝杆菌的增殖，而敏感性CH3鼠系则无法控制。也有人体HLA多形性和结核病患者的结核病易患性的报道。

1．肉芽肿 感染部位肉芽肿的形成是宿主限制感染的免疫组织学反应，提供一局限和抑制感染的组织学结构。

肉芽肿形成是结核性免疫的中心事件。Mackkaness证明在分枝杆菌感染时，单核细胞和巨噬细胞积聚，并发育成肉芽肿特有的上皮样栅栏细胞。Warren指出，血吸虫肉芽肿是抗原特异性的具有记忆特征的免疫学本质。随后Boros证明，结核菌素诱导肉芽肿形成也是一个细胞免疫学过程。

在自然宿主中，含菌微滴植入肺泡后被吞噬细胞吞噬。但巨噬细胞并不能控制感染，细菌增殖。吞噬细胞释放菌和其他趋化因子。释放的趋化因子吸引更多的吞噬细胞的聚集，释放的细菌被邻近和流入的其他巨噬细胞再度吞噬。如此的反复，开始了一个炎性反应过程，活化巨噬细胞局部聚集，原始肉芽肿形成。随着抗原刺激的持续增加，活化巨噬细胞出现上皮样细胞改变，线粒体、溶酶体、核和核仁的形态学改变，氧化活性和酶活性代谢改变，细胞因子分泌，抗菌活性提高，很多急性反应期蛋白，血管活性肽等因子合成和分泌。活化巨噬细胞往往融合成巨大细胞或郎汉斯巨细胞成为结核性肉芽肿的特征。

肉芽肿是T细胞介导的细胞免疫反应。基因敲除小鼠实验显示，IFN－γ和TNF－α是肉芽肿形成的必要的细胞因子。IFN－γ介导巨噬细胞活化和上皮样肉芽肿形成。外源性加入TNF－α受体处理，可阻止肉芽肿形成，消退已建立的肉芽肿。其他因子也参与肉芽肿构建，因为在SCID免疫缺陷小鼠中，提高IFN－γ和TNF－α水平后仍不发育结核性肉芽肿。

肉芽肿是一局限感染的组织学反应。依据巨噬细胞发育程度和杀菌活性，肉芽肿有上皮样和非上皮样肉芽肿两个类型，其中也存在一些过渡类型。在上皮样保护性肉芽肿中，巨噬细胞发育良好，可见特征性多核郎汉斯巨细胞。CD4＋T细胞介导的保护性免疫占优势，细菌增殖受到控制，无延缓型超敏坏死反应，不出现干酪和液化。但是，在一保护性免疫发育不良的非上皮样肉芽肿中，高菌负荷导致以组织坏死为特征的延缓型超敏反应占优势，肉芽肿中心出现干酪性改变和液化，空洞形成。

CD4＋T细胞和CD8＋T细胞比例也因肉芽肿类型而异。在一般的结核病患者的肉芽肿中，整个肉芽肿可发现CD4＋T细胞，而CD8＋T细胞则限于围绕在上皮样细胞的外围，也不见细胞踪迹。但HIV感染的结核病患者整个肉芽肿中CD8＋T细胞虽然存在，但不见CD4＋T细胞。此肉芽肿形成的IFN－γ信号可能是由自然杀伤细胞产生的。

Gonzalez－Juarrero指出，在结核分枝杆菌气雾感染C57BL／6小鼠的第1个月CD4＋T细胞和CD8＋T细胞进入肉芽肿，细胞数稳定增加。但CD8＋T细胞迁移较慢，其细胞数也少于CD4＋T细胞。此后局限化肉芽肿发育成熟，疾病转成慢性感染。此时聚集排列的T细胞主要是CD4＋T细胞，其中很多也含有相当数量的B细胞。而CD8＋细胞则分散到肉芽肿的外围。因此，CD8＋T细胞可能与慢性感染状态有关。但是，这些T细胞是由小动脉不断流进或是原位扩增尚不清楚。

2．细胞介导的抗菌活性 抗菌活性是保护性免疫的关键。T细胞介导的抗结核性保护性免疫反应是由CD4＋T细胞活化巨噬细胞抗菌活性和由CD8＋T细胞以及CD4＋溶解T细胞溶解或凋亡细菌过载巨噬细胞等反应共同介导的。

（1）巨噬细胞活化：Th1CD4＋辅助T细胞通过细胞因子和细胞接触两种途径活化巨噬细胞，提高细胞吞噬和拮抗胞内菌的能力。IFN－γ是保护性免疫的重要细胞因子。Rook指出，IFN－γ是通过诱导水解酶转化无活性的2，3－羟基维生素D3成活化态1，25－二羟基维生素D3。GM－CSF，TNRα／β也提高巨噬细胞活化。活化的巨噬细胞通过氧自由基和溶酶体内各种水解酶以及抗菌肽，金属离子螯合，多胺氧化脱氢产生氨中和酸性环境等多种途径达到的，显示出一个非特异性的杀菌活性。

CD4＋T细胞是活化巨噬细胞的IFN－γ主要来源。免疫CD4＋T细胞可过继传递保护性给结核分枝杆菌和卡介苗攻击的受体小鼠，抗CD4＋T细胞单克隆抗体处理可降低小鼠对结核性感染的耐受性。

（2）巨噬细胞的溶解：一些非活化或活化程度低的单个核吞噬细胞不能阻止细胞内细菌的增殖，造成了吞噬细胞的细菌过载。宿主需要一种机制阻止这样的高菌负荷。因此，高菌负载巨噬细胞的裂解就成为抗菌性保护性免疫的补充，由过载巨噬细胞裂解释放的细菌可由更为活化的巨噬细胞吞噬消化。CD8＋细胞毒T细胞（CTL）和CD4＋溶细胞细胞介导着结核分枝杆菌过载巨噬细胞的裂解。Ladel通过MHCⅠ分子编码基因敲除小鼠证明了细胞毒CD8＋T细胞在结核保护性免疫反应中也处于重要地位。在亚致死量结核分枝杆菌攻击时，CD4＋溶解T细胞参与了细胞裂解。

在动物模型中，活化巨噬细胞和细胞毒淋巴细胞在原发结核病控制的重要的作用在整个时期内是变化的。但是在人体中是否如此尚不得而知。

（3）巨噬细胞的凋亡：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，原是由基因控制的细胞自主的有序性死亡，以维持内环境的稳定的主动过程。发生程序性死亡的细胞染色质致密、断裂成小的碎片。细胞膜皱缩、凹陷、分隔，形成膜结构完整的泡状小体，称为凋亡小体。

多种途径可诱导感染巨噬细胞凋亡，如TNF－α／TNF－α受体依赖性支路的凋亡，NO诱导的凋亡等。结核分枝杆菌抗原特异性CD4＋溶解T细胞和CD4－CD8－溶解T细胞也可介导感染巨噬细胞的凋亡。

研究发现，除细胞溶解外，在结核性肉芽肿中也存在巨噬细胞凋亡现象。在肺结核患者支气管灌洗液中可发现高于正常人的具有凋亡细胞化学特征的巨噬细胞。在试管内，结核分枝杆菌感染巨噬细胞也可实验性诱导巨噬细胞凋亡。凋亡过程中细胞内部分菌群死亡，部分以休眠状态存留在凋亡小体中。因此，感染巨噬细胞凋亡可能是另一降低菌负荷的机制。

感染巨噬细胞的凋亡在宿主抗结核感染中有着其免疫学意义，①降低细胞内细菌负荷。细胞凋亡和坏死是剔除细菌过载巨噬细胞的两个不同的反应。坏死是一由细胞毒和（或）其他T细胞介导的细菌高负载细胞的溶解。细胞毒细胞释放穿孔素破坏吞噬细胞质膜完整性，吞噬细胞发生不可逆的损坏，细胞内含物和感染的菌一并释放到环境中。此过程中细菌并不死亡，并获得胞外环境的快速增殖。凋亡则是受基因调控的细胞自主的防御行为，凋亡小体形成过程中胞内部分细菌被杀灭，其他存活菌和胞内含物一起被厚壁凋亡小体包裹处于非活化状态而不释放到细胞外。因而存活菌并不加重整体的菌负荷。宿主通过凋亡减少了胞内菌数，限制了分枝杆菌生长环境，补充了IFN－γ介导的巨噬细胞杀菌活性的不足，应对了菌的胞外逃逸，限制了菌的播散。②降低炎性反应。凋亡小体是一厚壁小体，小体内结核分枝杆菌或被杀死，或被抑制，限制了胞内菌的生长及其诱导的炎性反应。因此，凋亡是一个免疫沉寂过程，不引起炎性反应，减轻了宿主的免疫负担。

结核分枝杆菌具有对抗巨噬细胞凋亡的能力。实验发现，结核分枝杆菌H37Rv毒株诱导的巨噬细胞凋亡率远低于卡介苗分枝杆菌和结核分枝杆菌无毒株。因此，结核分枝杆菌毒株应该存在对抗感染巨噬细胞凋亡的机制。实验发现，结核分枝杆菌毒株同时具有诱导凋亡和抗凋亡信号。结核分枝杆菌通过抗凋亡机制，下调凋亡率，改善细菌存活条件，成为结核分枝杆菌自身保护机制之一。因此，凋亡和细胞裂解同为巨噬细胞应对过载菌负载的主动机制。

（三）保护性免疫原

结核分枝杆菌有一个庞大的免疫原系统，它们启动了复杂的结核性免疫反应。

临床免疫学对抗原的研究主要是观察各免疫原及其介导的免疫反应，以此了解其对临床结核病显现、临床诊断、疾病的免疫治疗和菌苗组分的价值。

1．65kDa热休克蛋白 结核分枝杆菌65kDa热休克蛋白是研究较为深入的抗原蛋白，是结核病患者外周血淋巴细胞反应和抗体反应的显性抗原。此蛋白与其他热休克蛋白都是高同源性蛋白，具有分枝杆菌属内共同决定簇，是结核病血清学抗体交叉反应和背景细胞免疫的原因之一。有报道表明此抗原和人风湿性关节炎有关，Kempsell通过反转录PCR在患病滑膜组织中检测到此蛋白的存在。

2．38kDa蛋白 Daneil等用单克隆抗体TB71亲合层析得到一脂蛋白，命名为抗原5。原先鉴定分子量为35kDa，后更正为38kDa。Anderson（1989，1990）也纯化到－38kDa蛋白称为b，是磷酸转运蛋白。定位指数（培养液中蛋白含量／洗涤菌超声裂解物蛋白含量）很低，显示是低分泌蛋白，主要定位在胞壁蛋白。

对7个豚鼠系的研究发现，在5个鼠系中，38kDa蛋白是免疫显性蛋白。可刺激结核感染人和致敏豚鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞反应。Fonseca报道38kDa蛋白有一CD8＋细胞毒T细胞决定簇，可上调MHCⅠ类表达。38kDa可在豚鼠皮肤反应中显示出较好的种特异性反应原活性，但在人体上则无法观察到如此的特异性。

Daniel等介绍38kDa抗原仅存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，成为结核病血清学抗体检测最为广泛采用的抗原，在临床观察中报道了很好的ELISA诊断价值。但是，实际上38kDa蛋白还具有其他分枝杆菌共同决定簇。Benjamin证明抗原5蛋白和一些非结核分枝杆菌患者血清有交叉反应，在人体中并不是完全特异性的抗原。

3．35kDa蛋白 仅存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，具有T细胞和B细胞决定簇。

4．抗原85复合物 结核分枝杆菌滤液免疫电泳谱中，在分子量30／31kDa电泳带上显示出一多带的抗原85复合物，曾有多个名称，α抗原和抗原6等。85抗原复合物有A、B和C 3个部分，基因组分析还存在第4个成分C′。此复合物是分泌性蛋白，有可与体液中纤维结合素结合能力，是巨噬细胞吞噬的介导因子之一。抗原85复合物是分枝杆菌属共有蛋白，具有结核分枝杆菌种特异性和共同决定簇。

85B是一30kDa在分枝杆菌胞壁合成中重要的分枝酰转移酶，也是纤维结合素结合蛋白，介导吞噬活性。85B也是很好的体液和细胞免疫原。在致敏动物中，30kDa蛋白的皮肤变态反应特异性优于结核菌素蛋白。健康人T淋巴细胞对30kDa显示强反应性，而活动性结核病则无。可见30kDa蛋白可能是免疫调控蛋白，可供免疫菌苗选用。

最近有报道指出抗原85A和85C可在试管内和巨噬细胞内表达，但抗原85A仅在巨噬细胞内表达。

5．ESAT－6抗原 ESAT－6抗原是由结核分枝杆菌短时间培养滤液中获得的低分子量纯化物质，是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分泌的蛋白抗原，但卡介苗分枝杆菌并不分泌此蛋白。ESAT－6分子量30／31kDa，其两个主要决定簇可诱导细胞分泌IFN－γ。ESAT－6可被小鼠和豚鼠记忆效应淋巴细胞识别，在保护性免疫记忆中起着重要作用。

Mariani报道，抗原EAST－6和抗原85B仅在试管培养物中可以检出其表达，在巨噬细胞则不能检出，这或许也是细菌避免宿主保护性免疫机制的手段之一。

6．分枝杆菌胞壁脂蛋白和脂多糖 分枝杆菌胞壁中阿拉伯半乳聚糖是体液免疫很好的抗原，但是无介导细胞免疫活性。脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）也是好的体液免疫原，在实验动物和活动性结核病患者很易检出LAM抗体。在人巨噬细胞系中，结核分枝杆菌毒株LAM可通过清除氧自由基，抑制蛋白激酶C活性和阻断IFN－γ基因转录活性等途径抑制巨噬细胞活化和杀菌活性，而与菌持留现象有关。LAM也可选择性诱导免疫抑制因子，如转化生长因子－β（TGF－β），但是不诱导TNF－α。

三、HIV和结核性双重感染结核病的免疫反应

结核性免疫是一以T细胞为核心的细胞免疫。因此，侵染CD4＋T细胞的人获得性免疫缺陷病毒（HIV）感染必然影响整个结核性感染事件。HIV和TB结盟已成为令人心悸的现代的白色瘟疫。HIV阴性结核感染者终身发病率为5%～10%，而纽约的静脉吸毒者2年随访的HIV感染者的年发病率在7．9%，其对结核病流行的威胁可见一斑。

同时，结核病也是AIDS患者常见的早期事件，较其他疾病常早出现6～9个月。HIV感染者快速发展成活动性结核病，显示原发结核性感染的非典型肺部表现。

HIV感染降低了原发结核病感染所需菌量水平，常出现小环境暴发流行，原发感染和继发感染都快速进展和广泛性播散。

HIV感染对巨噬细胞产生多种效应，影响巨噬细胞表型和功能：抗原呈递能力下降，改变细胞因子类型，淋巴细胞因子IL－2分泌减少，巨噬细胞活化水平降低，而单核细胞因子IL－10增加，诱导巨噬细胞脱活化，氧代谢能力下降等。因而增加了HIV感染者原发结核病的危险。

HIV感染者的结核性淋巴结炎的肉芽肿形成受到了患者的CD4＋T细胞数的限制。CD4＋T细胞数＞200时，肉芽肿中存在巨噬细胞和巨大细胞，但低于此水平时，肉芽肿形成困难，病变难以局限化。正常肉芽肿中缺失原本存在的CTL和NK细胞，代之以非活化CD8＋T细胞，肉芽肿坏死。

HIV降低了宿主的反应能力，增加了结核菌素皮试阴性。乌干达的HIV感染健康妇女结核菌素反应超过3mm者为48%，而HIV阴性同龄妇女为82%。一系列分枝杆菌抗原检测HIV感染者的皮试反应性表明，在CD4＋T细胞计数＞500个体中皮试阴性率＞10%，低于此水平时则无反应性增加，CD4＋T细胞＜200时为75%，而CD4＋T细胞＜50时，则100%的个体无反应。在扎伊尔进行的50名HIV感染者的CMI多项指标测验表明无反应性为46%。也有报道指出，HIV感染者中结核性感染可复强结核菌素反应性，而不是进一步降低。36%的HIV感染的结核菌素阳性者发展活动性结核病，而结核菌素阴性的HIV感染者为8%。乌干达的结核菌素反应强度＞10mm的HIV感染者中结核病发病者为68%，而低于此强度的为18%。

HIV和TB相互加速对方的感染进程。HIV感染的肺结核患者的肺灌洗液细胞的HIV负荷量高于无结核感染的HIV患者。试管内研究也发现结核分枝杆菌和PPD抗原可提高培养的人单核细胞和淋巴样细胞系中HIV表达。

四、结核性感染的体液免疫

体液免疫是早在19世纪由巴士德时代建立的医学免疫学的重大成就，自然受到结核病临床免疫学和临床医学的关注。虽然对体液免疫问题巴士德和柯赫两人曾争论不休，但鉴于体液免疫研究的成熟性及其检测的简便，100多年以来几乎每一个体液免疫领域新的进展都随即在结核病血清学诊断中进行检验。遗憾的是至今未获得满意的结果。

目前为止，除了结核分枝杆菌的抗结核抗体及补体和巨噬细胞上相应受体结合协同介导了吞噬作用外，始终未能发现体液免疫与结核病敏感性和耐受性之间的相关性，也未能发现结核性免疫中体液免疫和细胞免疫之间存在重大关联。过继免疫证明免疫血清不能介导受体小鼠抗结核分枝杆菌感染，而免疫小鼠T淋巴细胞则可成功过继保护性结果之后，20世纪中期确立了细胞免疫在结核病免疫中心地位。因此，迄今为止尚未发现体液免疫参与结核病的发生、发展和转归的重大证据。在临床中，如镰刀形细胞病、多发性骨髓瘤的一些体液免疫缺陷性疾病患者对结核分枝杆菌易患性并无明显增加。但是，在细胞免疫缺陷人群中，如免疫缺陷病毒感染、慢性肾衰竭、糖尿病等就成为结核性感染的危险因素。我们认为体液免疫是生物进化中更为高级的阶段，有很好的特异性和效应性，而结核性免疫的细胞免疫是由分枝杆菌抗原诱发的非特异性抗菌活性，更接近原始态，可能反映古结核菌的历史渊久。如此久远的进化，当前仅用T细胞为中心的细胞免疫解释也可能是过于简单，体液免疫和细胞免疫之间的关联仍应得到关注。但是，到目前为止，对于结核免疫反应中B细胞的活化事件鲜有深入的研究报道。

在结核病患者中确实存在着抗结核分枝杆菌抗原的抗体，并与细胞免疫呈高涨和低落相对的镶嵌样关系。研究也发现，在结核性感染的细胞免疫发育的同时，宿主也产生对抗结核分枝杆菌抗原抗体反应，并显示与疾病存在和转归有某种正向和负向平行关系，成为结核病血清诊断的依据。鉴于此以及血清学诊断的简便，快速易行与在其他传染病诊断的重大成就，血清学诊断始终是临床结核病免疫学诊断关注的焦点。

（一）抗原抗体反应

在结核病患者中存在抗结核分枝杆菌抗原的IgM、IgA、IgG各类型抗体。IgM是抗多糖抗原抗体，一般认为是在感染开始时产生的抗体，期望能成为早期感染的指征。在小鼠实验中似乎也有望鉴定早期结核性感染。但是，随后的人群研究未能得到证实。同时，因IgM滴度低检测结果的可信性程度差，难以成为临床可信的方法。IgA抗体水平一般和IgG平行，但水平低，检测困难。因此，一般的血清诊断是以检测抗结核抗原IgG抗体为基础的。1985年Daniel介绍了抗原5IgG抗体的动力学曲线，发现与结核病的平行性，但也发现抗体产生存在着感染早期的延误和治愈后的滞后现象。但是，此类研究并不很多，依据不多的动力学资料得到抗体检测和疗效判定的结论是应该审慎的。此外，人群中也存在很大的个体差异，使得其平均值的意义难以解释。

特异性抗原是结核病血清诊断的基础。结核分枝杆菌有着由蛋白质、糖类、脂质以及它们相互结合物等构成的丰富抗原库。就其在细胞上定位可分为分泌抗原、胞壁抗原和胞质抗原。就其纯化程度可分为粗抗原、半纯化抗原和纯化重组抗原。而就其决定簇在分枝杆菌属内的分布而言，可分为4类，Ⅰ类是分枝杆菌属各种间共同抗原；Ⅱ类抗原是缓慢生长分枝杆菌共同抗原；Ⅲ类是快速生长分枝杆菌共同抗原；Ⅳ类是种特异性抗原。Daniel鉴定和命名了结核分枝杆菌培养滤液的一些蛋白，抗原1、阿拉伯甘露聚糖；抗原2，阿拉伯半乳聚糖；抗原3，葡聚糖。此3种抗原是属于Ⅰ类属间共同抗原。抗原5是含结核分枝杆菌特异性决定簇的糖蛋白，抗原6和抗原7是广泛分布的蛋白抗原。

应该指出，不同抗原可能有着相同的决定簇，而在特异性抗原单体上也可能存在不同的非特异性决定簇。因此，抗原特异性问题实际上更为复杂。

血清学诊断初期多采用粗抗原，如菌悬液、培养滤液和糖提取物等。至今仍有人采用粗抗原旧结核菌素、PPD、胞壁和胞质抗原。20世纪60年代建立了结核分枝杆菌抗原参比系统，进行了一些抗原纯化和免疫原性鉴定的努力。抗原5就是当时的代表性成就。随着20世纪20年代的单克隆抗体技术和20世纪70年代开始的重组技术的建立，出现了大量的亲和纯单体抗原。目前，进行生化、抗原性等研究的单体抗原几近百种之多。

1．38kDa蛋白抗原 38kDa蛋白是一免疫显性糖蛋白免疫原，在Anderson系统中称为抗原5。38kDa抗原是一磷酸转运蛋白（PstS），虽属分泌性蛋白质，但分泌指数很低，主要在细胞壁中，与大肠杆菌和分枝杆菌属各种的磷酸转运蛋白有相当的同源性。它含有7个结核分枝埃希菌特异性决定簇，是结核病血清诊断中采用最广泛的抗原，但实际上仍存在一些非结核分枝杆菌共同决定簇。Danei指出，抗38kDa IgG抗体是与高菌负荷相关联的。一般涂阳结核患者的阳性检出率可达49%～87%，而涂阴患者则低得多。

2．30／31kDa抗原 此类抗原是另一分泌抗原，其生物学功能为纤维结合素结合蛋白。临床研究发现有相似38kDa抗原的结果，也是与菌负荷相关的抗原。

3．脂阿拉伯甘露聚糖（LAM） LAM是各分枝杆菌胞壁的主要成分，是分枝杆菌共同抗原。组织胞浆菌也含有丰富的甘露聚糖，应存在分枝杆菌属内交叉反应。

4．抗原60（A60） 是一由卡介苗分枝杆菌培养滤液中凝胶层析的成分，实际是含30余种蛋白多糖脂质的混合物，LAM可能是其主要成分。其交叉免疫性不应忽视。

（二）结核病血清学诊断在结核病诊断中的价值

100多年来人们对结核病血清学诊断进行了坚持不懈的努力。每个新出现的血清学方法都会在结核病诊断中进行研究，但由于抗体滴度低，终未取得完全满意的结果。Nasau将Engvall于1972年引入放大抗体反应信息的酶联吸附分析后，结核病的血清学诊断才发生根本的改变。血清学诊断逐渐成为一种辅助性结核病实验室诊断方法。上市的抗体检测试剂盒已更新多次。目前临床上常用金标斑点酶联分析是一种简便快速的方法，便于临床使用，但检测灵敏度低于ELISA法。应该指出，技术上虽经改善，结核病体液免疫的局限性的基本情况依旧。

虽然在菌阳结核患者血清显示更多的阳性检出率，其价值也是对涂片结果的补充。但是，令人遗憾的是，恰恰在对人们寄以更大期望的涂阴、菌阴和少菌肺结核病、肺外结核病以及儿童结核患者诊断中，血清学诊断阳性检出率也较低，其结论也无法获得细菌学支持。因此，由于体液免疫在结核病发生、发展和结果的相关性未得以证实，抗体反应延缓性和结核分枝杆菌抗原中存在广泛的交叉反应性等多种缺陷，血清学诊断在结核病诊断的价值受到了限制。在目前的结核病临床实践中，血清学诊断仍然是在一个综合评估体系中进行的评估，应该看作是细菌学诊断和临床诊断的一个补充。单纯依据血清学检测结果鉴别诊断是应该避免和慎重的。敏感性和特异性是一对彼此限制的参数。在决定其阳性切值时应该考虑地区的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌感染和卡介苗接种等背景。但是，一个商用血清学诊断系统很难满足这样的要求，往往是采用少数血清进行标定。鉴于制剂的生物学波动，通常需要采用不同的包被抗原量来保证其所需要的阳性检出敏感性。应该指出，增加包被抗原量虽然提高阳性检出率，但可能严重损害试剂盒的特异性，特别是在需要鉴别诊断的病例中特异性处于更为有限考虑的地位。在一般的临床实践中，医师更多的关心支持预定诊断的高敏感性，而忽视对系统的特异性的考核。在一些临床验证实验中也往往采用菌阳结核重症结核患者与非相关的患者或正常人比较，而忽视分枝杆菌属内和抗原相关属感染抗原交叉人群患者的交叉反应性可能性。例如，普遍认为是结核分枝杆菌种特异性的38kDa蛋白实际存在着与一些非结核分枝杆菌的交叉决定簇，也和一些NTM感染患者血清有交叉反应，在一些临床验证研究往往忽视和掩盖非结核分枝杆菌病血清的对比研究结果。但是，这样的特异性确定恰恰在更需要血清学支持的菌阴疑诊患者中更为重要。因此，鉴于当前抗原特异性的相对性和血清学检测临床实际要求，特异性应该是更为看重的临床诊断指标。

目前尚无令人满意的临床血清学诊断方法，缺乏特异性抗原就是主要的原因之一。抗原抗体反应仅是对结核病细菌学诊断的补充方法之一。

五、检测方法

我国的结核病疫情相当严重，结核病的早期、快速诊断对于早期化疗和控制传播都有极其重要的意义。虽然结核病细菌学检查是结核病诊断的“金标准”，然而涂片阳性率低、培养耗时长，不能满足临床需要，尤其是菌阴肺结核、肺外结核和儿童结核的诊断十分困难，而免疫学检查标本来源方便、简便、快速、灵敏、特异，目前已成为结核病重要的辅助检查手段。本文就结核病免疫学诊断的研究进展进行简要地介绍。

（一）细胞免疫诊断

细胞免疫检测是通过检测细胞免疫功能进行疾病的诊断，它包括T细胞的数量、功能及其产物如细胞因子等的检测。

1．体内皮肤试验 结核菌素试验是一种诊断结核的工具。临床常用的结核菌素主要有两种：一种称“旧结素”（OT），另一种称“纯结素”（P．P．D．）主要含结核蛋白，它的特异性和纯度较旧结素为好。

结素试验（结核菌素试验）是一种敏感性很高，特异性很强的检查方法，试验反应阳性对诊断结核感染有重要价值，但它不能诊断肺部有没有结核病或确定病变性质。对3岁以下的婴幼儿未接种过卡介苗而结素反应阳性者，应考虑有活动性结核病，另外，结素反应阳性也是接种卡介苗后所产生变态反应的表现，在流行病学上常用来考核卡介苗的接种效果。

另外，作为一种结核菌素试验的替代，一些其他的测试也正在发展。如Quanti FERONTB Gold，作为一种体外测试方法已在美国被FDA批准，在欧洲获得了CE标志认证，在日本已经被MHLW批准。

2．T细胞亚群分析 结核病患者存在明显细胞免疫功能紊乱，其外周血CD3、CD4T淋巴细胞减少，尤其是耐多药结核病下降更明显；CD8T淋巴细胞、γδT淋巴细胞增多，而且再次感染时可出现明显的记忆效应；CD4／CD8比值降低，同时伴有T细胞活化功能障碍，尤其是活动性结核病更为显著；但结核性胸腔积液和脑脊液中淋巴细胞比例、CD4T淋巴细胞显著升高。分析T细胞亚群的变化对于病情监控、疗效判定和预后判断都具有重要意义，可指导临床采取相应措施，提高患者的细胞免疫功能，加速结核菌的清除，使病情缓解或治愈，并有助于结核性和癌性胸腔积液的鉴别。

3．体外T淋巴细胞增殖实验 又称γ－干扰素释放实验［Interferon－γ（interferon－gamma）release assays（IGRAs）］。由于结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT－6、CFP－10（或合成多肽）可刺激结核菌感染的人和牛外周血单个核细胞（PBMC）产生增殖反应和大量的γ－干扰素（IFN－γ），而这些抗原具有种属特异性，在非结核分枝杆菌中不存在，其特异性显著高于结核分枝杆菌超声抗原和培养滤液等体内刺激实验（TST）。因此，通过检测特异性抗原刺激释放的IFN－γ量或计数释放IFN－γ外周血T淋巴细胞数目（ELISPOT TB）能鉴别结核感染者和BCG接种者，用于结核病的辅助诊断。

2005年12月FDA批准的Quanti FERON－TB Gold Test（简称QFT－Gold）是一种T淋巴细胞增殖实验试剂，QFT－Gold试剂以ESAT－6、CFP－10、TB 7．7（p4）蛋白为特异性刺激抗原，检测时将全血样品置于肝素抗凝管内并与这些抗原混合，以不加抗原的对照管作对照。感染结核分枝杆菌的患者血中T细胞会和这些抗原反应产生IFN－γ，结果可用ELISA法检测。

T－SPOT．TB和Quanti FERON－TB Gold比结核菌素皮肤试验有更高的诊断特异性。尽管如此，不确定结果和阳性结果的比率在两种血液检测方法中还是有差异的，这表明在日常临床实践中这两种方法可能提供不同的结果。

目前IGRAs已在英国、美国及澳大利亚等国家已广泛用于结核感染的辅助诊断，其最大争议在于对IGRAs检测结果的解释，活动性、高发病区隐性感染、结核病患者接触者IGRAs如何区分一直存在争议。

4．体外非特异性细胞因子检测 活动性肺结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎患者血液中或局部肺组织、胸膜组织、脑膜组织的T淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞在结核分枝杆菌抗原的激活下，释放可溶性IL－2受体（sIL－2R）和膜IL－2受体（mIL－2R）、IFN－γ、TNF－α、IL－18和IL－28的水平不同，与正常人或非结核性疾病差异有统计学意义。因此，采用双抗体夹心ELISA检测其在血清、胸腔积液、脑积液中的水平，对结核病具有辅助诊断和鉴别诊断价值，对抗结核疗效和病情转归的评价具有一定的临床意义。

5．T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白表达的测定结核病患者及肺炎患者 T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白的表达显著高于肺癌患者。通过测定T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白的表达有助于肺结核与肺部肿瘤的鉴别诊断。

6．红细胞免疫功能测定 红细胞CR1具有黏附C3b、C4b能力，其强弱的测定可作为估价红细胞免疫黏附功能强弱的指标之一。测定结核患者红细胞免疫黏附能力和红细胞免疫黏附促进因子，结果两者均明显低于正常人，结核病患者红细胞免疫促进因子下降可能是其红细胞免疫黏附功能降低的重要原因之红细胞免疫功能测定可成为分析结核患者免疫功能状态的一个新指标，为结核患者的免疫治疗、判断预后提供依据。

7．酶学诊断 腺苷脱氨酶（ADA）与细胞免疫反应相关，ADA及其同工酶在结核性胸腔积液、腹水、脑积液、唾液中与血清中的比值显著高于其他疾病。溶菌酶在结核病细胞免疫中起着重要作用，溶菌酶活性在结核性胸腔积液和腹水中与血清中的比值也显著高于其他疾病。因此，ADA及其同工酶的检测、溶菌酶活性的测定有助于各种结核病的诊断和鉴别诊断。近年来又陆续报道了一些其他酶类的诊断应用价值，如乳酸脱氢酶、胆碱酯酶、淀粉酶及其同工酶、丙酮酸激酶、血管紧张素转化酶的检测。

（二）体液免疫诊断

体液免疫诊断是通过检测体液免疫功能进行疾病的诊断，它包括体液中抗体、抗原和各种可溶性免疫分子的检测。

1．抗结核抗体的检测 抗体存在于各种体液标本中，如血液、胸腔积液、脑脊液、腹水、关节腔积液等，由于血清是主要的检测样品，因此又称为血清学试验。分枝杆菌蛋白质、糖脂等具有抗原性的大分子物质均可刺激机体产生相应的抗体，20世纪70年代由于体液免疫反应放大技术的进步，采用酶联免疫法（ELISA）检测患者血清中的结核特异性抗体，已成为结核病常用的辅助诊断手段之一，尤其是对于菌阴肺结核、肺外结核、小儿结核病的诊断与鉴别诊断具有重要意义。近十几年来胶体金和膜反应技术的发展，金标斑点免疫渗滤试验、斑点免疫层析试验检测抗原抗体反应已成为无需特殊仪器的快速诊断技术。由于结核病患者免疫功能不同而导致对结核分枝杆菌抗原识别的差异，此外结核病患者对抗原的识别存在阶段特异性，目前的研究也已表明任何一个单一的抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核病患者血清中的抗结体，结核病患者的抗体反应是针对许多结核分枝杆菌抗原的。因此，单一抗原检测阴性并不能说明结核病患者缺乏抗体反应，而是缺乏合适的检测试剂。从结核分枝杆菌培养滤液中提纯蛋白抗原，较繁琐、费时。近年来，国内外学者应用基因工程技术克隆、表达结核分枝杆菌基因，简便地获得了大量结核分枝杆菌重组蛋白抗原，其成分单纯、性质稳定，筛选多个纯化的结核病特异性抗原组成联合抗原是目前血清学诊断的研究方向，这不仅增加结核病血清学诊断的灵敏度和特异度，而且具有较好的稳定性，易于标准化。如结核分枝杆菌CFP－10、ESAT－6、MPT－63、MPT－64、Ag85A、Ag85B、katG、16kDa、磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶（PEPCK）等蛋白与38kDa具有互补性，可提高其检测的灵敏度，尤其是MTB－48和MTB－81蛋白可在HIV结核共感染人群中检出抗结核抗体。

2．结核特异性抗原的检测 结核分枝杆菌在生长早期、中期可分泌释放一组蛋白（分泌性蛋白质）于菌体外，而在细菌对数生长的晚期细菌死亡后释放出胞质蛋白。因此，检测体液标本中结核抗原可作为结核分枝杆菌存在的直接证据。结核分枝杆菌是胞内寄生菌，通过检测巨噬细胞或单个核细胞内的结核抗原可提高检测的灵敏度和特异性。目前常用多克隆或单克隆抗体通过ELISA双抗体夹心法或斑点一ELISA法检测体液标本或痰标本中特异性抗原（如A60、LAM、Ag85复合物，55kDa、20kDa抗原等），也有应用放射免疫及免疫荧光等方法，灵敏度可达70%以上，特异性达85%以上。但由于需制备高亲和力的单克隆抗体，限制了该方法在临床上的应用。通过指数级富集配体的系统进化技术（SEL EX）可获得与靶分子亲和力高、特异性强的寡核苷酸，称之为“适配子”。寡核苷酸适配子比抗体更易获得、更稳定、并具有较长的保存期，应用寡核苷酸适配子检测体液标本中结核分枝杆菌抗原是一种新型检测技术。随着质谱仪的发展和蛋白质组学研究的深入，产生了蛋白质指纹图谱的诊断新技术，该技术是通过质谱分析不同疾病血清中循环蛋白的差异，以特异性差异蛋白作为诊断标志物来诊断疾病。2006年，Agranoff等首次研究了结核患者血清的蛋白指纹图谱，采用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱SELDI－TOF－MS分析179份活动性结核患者组和N170份非结核对照组血清蛋白质组，检测具有潜在诊断价值的生物标志物，结果显示诊断结核病的灵敏度为93．5%，特异性为94．9%，并不受HIV状态的影响。吴雪琼等比较129例活动性肺结核血清和135例对照血清蛋白指纹图谱，发现了50个差异蛋白峰（P＜0．01），选择3个蛋白峰（5 643、4 486、4 360m／z）建立诊断模型，诊断活动性肺结核的灵敏度为96．9%，特异性为97．8%。通过气相色谱／质谱技术测定体液标本中结核分枝杆菌特有的菌体结构成分硬脂酸，可辅助诊断结核病尤其是结核性脑膜炎。

3．循环免疫复合物 结核分枝杆菌抗原与相应的抗体相结合形成免疫复合物，是机体排除抗原的一种保护性反应，它与机体的免疫功能密切相关，可作为评价机体免疫功能的有效指标。在正常情况下形成的免疫复合物能被机体的免疫系统所清除。在结核病患者血清、脑脊液等体液中均可形成循环免疫复合物（CIC），血清中CIC检测的阳性率可达77．3%，与患者痰菌是否阳性无明显相关性。此外，肺结核患者血清中IgM激活C1q类双特异性循环免疫复合物（IgM／C1q－TCIC）的水平明显高于肺癌、肺炎和健康人对照组，而且活动性肺结核组明显高于非活动性肺结核组。由此可见，体液标本中CIC的测定有助于结核病的辅助诊断。

4．α－1－酸性糖蛋白 α1－酸性糖蛋白（AGP），是一个主要的急性期蛋白，在感染时由肝产生，通过分析血清等体液标本中AGP浓度有助于炎症与肿瘤的鉴别诊断，如在结核性胸腔积液中AGP显著高于癌性胸腔积液，但结核病及其他感染性疾病血清中总AGP浓度均显著升高，难于鉴别。然而AGP 2，3，4触角的寡糖与它的糖基化部分结合的部位存在微观不均一性，结核病患者血清中AGP糖基化程度显著低于非结核炎症患者，通过糖基化差异分析鉴别诊断的灵敏度为86%、特异性为93%。

5．血清透明质酸（HA） 血清透明质酸（HA）是一种大分子葡萄胺多糖，广泛存在于细胞外基质中，主要来源于肺间质细胞，肺间质细胞尤其是成纤维细胞可合成HA。通过放射免疫分析法测定肺结核病患者血清中HA含量的研究显示，浸润型和慢性纤维空洞型肺结核患者显著升高，病变广泛组HA含量显著高于病变局限组，而非活动性肺结核与对照组之间差异无统计学意义。结果表明HA与肺纤维化程度相关，是肺纤维化的标志物。