细胞免疫学测定

一旦MTB侵入肺实质开始繁殖，机体则产生原发型结核性肺炎，于肺实质发生免疫反应。即MTh与组织中巨噬细胞和淋巴细胞相互作用，巨噬细胞吞噬MTB，激活循环T细胞，于6～10周后，致敏T细胞产生淋巴因子，加速细胞内杀灭MTB。淋巴细胞和巨噬细胞释放水解酶，引起结核病灶干酪性坏死，经抗结核治疗后纤维化或钙化而治愈。但病灶中MTB仍可生存几十年，当机体免疫力低下时，还可能重新复活。因此，对机体的免疫功能测定，有助于结核病的辅助诊断，同时，当发现机体免疫功能低下时，则可采取免疫制剂辅助治疗。

一、T细胞测定

（一）T细胞E－花环试验

1．原理 T细胞是一个多功能的细胞群体，其表面有绵羊红细胞（SRBC）受体，可与SRBC结合形成花环，在4℃反应2h形成的花环，代表T细胞总数，称Et－花环。

2．试剂

（1）肝素抗凝血药：每100ml Hank液中加入肝素12 500U，分装试管，每管0．5ml（含肝素62．5U），可抗凝3ml全血。

（2）Alsever血细胞保存液：取枸橼酸钠0．8g、葡萄糖1．9g和NaCl 0．42g溶于重蒸馏水1 000ml内，分装后115℃15min灭菌。

（3）Hank液：制备该溶液需用经玻璃蒸馏器重蒸馏的蒸馏水，化学试剂均为分析纯。

①原液甲：NaCl 160．0g；KCl 8．0g；MgSO4·7H2O 2．0g；MgCl2·6H2O 2．0g溶于800ml蒸馏水中。CaCl22．8g溶于100ml重蒸馏水中。将上述两液混合后补加蒸馏水至1 000ml，加2ml三氯甲烷作防腐剂，4℃保存。

②原液乙：Na2HPO4·12H2O 3．04g；KH2PO41．2g；葡萄糖20．0g溶于800ml重蒸馏水中，再加入酚红溶液，酚红0．4g，边研磨（于玻璃研钵内）边滴加0．1mol／L NaOH至酚红全溶，补加重蒸馏水至1 000ml，加2ml三氯甲烷作防腐剂，4℃保存。

③使用时将原液甲1份、原液乙1份、重蒸馏水18份混合后，分装小瓶115℃灭菌10min备用。

（4）5．0g／L水解乳清蛋白（lactalbumin hydrolysate）：称取0．5g乳清蛋白水解物，溶于100ml Hank液中，115℃灭菌10min，用时以60．0g／L NaHCO3调pH至7．4。

（5）绵羊红细胞（SRBC）：新鲜采集可保存的（用Alsever液4℃保存的SRBC，可使用2周）SRBC，用生理盐水洗涤3次，末次洗涤应固定转速与时间（每分钟2 000转，30min），用生理盐水配成1%细胞悬液。

（6）淋巴细胞分离液：市售和自配均可。自配，即90g／L Ficoll 24份加339．0g／L Hypaque（450．0g／L Hypaque 15．06ml加重蒸馏水4．94ml）10份，混匀（密度为1．077），4℃保存，或40．0g／L Ficoll 19ml加60．0g／L泛影葡萄糖胺20ml，1．0g／L NaHCO381ml，混匀（pH7．2～7．4，密度约1．075），分装安瓿，每支2ml，113℃20min灭菌，室温可保存3年。

3．方法

（1）淋巴细胞悬液的制备取肝素抗凝血1ml，加入37℃预温的生理盐水1ml中，混匀后轻轻加于1ml淋巴细胞分离液上，每分钟3 000转离心10min后，用毛细滴管尖伸入单个核细胞层，轻轻吸出全部细胞悬液。用37℃生理盐水洗2次，每次以每分钟3 000转离心10min。弃上清，将沉积细胞用pH7．4含10%小牛血清的Hank液配成142×106个／ml的细胞悬液。

（2）成花取淋巴细胞悬液0．1ml，加0．1ml SRBC（白细胞计数为1×105～2×105，SRBC约为2×107个），置37℃水浴5min，每分钟2 000转离心5min，置4℃1～2h。

（3）固定：轻轻混匀细胞后，加0．8%戊二醛（25%戊二醛1ml加4．5g／L NaCl 30．25ml），混匀后，置4℃15min。

（4）制片与计数可制干片或湿片计数，前者染色可长期保存，适宜复查，亦可用油镜仔细分辨成花细胞的类别，后者更为简便。

①干片法：将全部细胞悬液吸出，轮流滴在2张干净的玻片上展开，自然干燥，经甲醇固定后，用0．067mol／L稀释的瑞氏染液（Wright）或吉姆萨（Giemsa）染液染色10min，水洗待干后，镜检计数。

②湿片法：在载玻片上滴1滴10．0g／L甲苯胺蓝（Toluidine blue－O）染液。将混匀的成花细胞悬液1滴加入其上，立即盖上玻片，镜检计数。

4．结果 在高倍镜（或油镜）下计数200～400个淋巴细胞，凡结合有≥3SRBC者，计为E－花环细胞（若3个以上淋巴细胞粘在一起形成的花环不计在内），算出成花百分率。

5．参考值 血液，60%～80%。

6．临床意义 活动性结核病E－花环细胞百分率明显低于正常健康人。严碧涯等研究结果表明，各型（临床分型）结核患者E－花环细胞百分率均降低，且随有效抗结核药物的治疗、X线病灶的吸收而逐渐恢复正常。

7．方法学评价和影响因素

（1）该试验是测定T细胞总数，反映机体细胞免疫水平，但戊二醛可改变SRBC的表面特征使其与少数B细胞结合，使结果偏高。

（2）采血后应立即分离淋巴细胞（最好不要超过4h）。若不能立即进行时，只宜室温放置，而不得4℃存放，否则影响成花率。

（3）温度变化不大或操作不当，如悬混成花细胞用力过猛，会使部分E－花环散开，故全部操作过程在37℃水浴内或25℃室温进行，操作应轻柔。

（4）小牛血清可加强反应，但小牛血清个体差异较大，需经严格筛选，并于56℃灭活30min，用SRBC吸收后供试验用。

（二）T细胞亚群检测

T细胞是一个复杂不均一的群体，根据其不同发育阶段，表面标志和免疫功能等不同，T细胞可分为若干亚群。按其功能可分为辅助T细胞（T－helper cell，Th）、抑制性T细胞（T suppressor cell，Ts）、细胞毒T细胞（T－cell，Tc）、诱导T细胞（T induce，Ti）等，其中Th和Ts是重要的免疫调节细胞，对机体免疫应答的调控和维持免疫稳定起着十分重要的作用。因此，测定结核患者外周血中Th和Ts等亚群的百分率及两者之比，可了解结核患者的免疫调节功能，观察其动态变化与结核病的关系，对估计预后及采用免疫制剂辅助治疗等均有参考价值。

检测T细胞亚群现多用T细胞单克隆抗体（如OKT系统），检查外周血中T细胞OKT单克隆抗体（McAb）有OKT3、OKT4和OKT8。

OKT3：能识别人外周血全部T细胞，相当的抗原分子量为29 000，为IgG2a。亚类单抗，能结合补体，有细胞毒活性。

OKT4：能识别Th／Ti亚类细胞，相应的抗原分子量为54 000，为IgG2a亚类单抗，能结合补体，有细胞毒活性。

OKT8：能识别Ts／Tc种类细胞，为IgG2b亚类单抗，能固定补体，有细胞毒活性，相应的抗原分子量为32 000。

用McAb检测T细胞亚群常用方法有3种：①光镜法（SAC花环和红细胞花环法）；②间接免疫荧光法；③流式细胞仪法。前2种方法较为简便；后者更为准确，但仪器昂贵，尚不能在一般实验室推广应用。

1．花环法 花环法常用的有间接金黄色葡萄球菌CowanⅠ株（Staphylococcus aureus CowanⅠ，SAC）花环法和抗体致敏的红细胞花环法。

（1）间接SAC花环法

原理 将SAC菌体与兔抗鼠IgO抗体（第2抗体）相结合，然后加入T细胞和OKT McAb（第1抗体）的混合物中，孵育，洗去未结合的抗体。如果第1抗体已与细胞表面抗原相结合，则结合有SAX的第2抗体与之结合，经制片染色后，可见阳性细胞周围有SAC菌体形成的花环。

试剂

①SAC－Ig的制备：取10%SAC菌体1ml，离心去上清，加兔抗鼠抗体［效价1∶（16～32）］0．1ml，置4℃孵育30min，用Hank液洗3次，洗去未结合的抗小鼠IgG，再将菌体悬于1ml的RPMI－1640液中，即成SAC－Ig。置4℃下保存，可用2周。

②淋巴细胞制备：常规方法分离外周血淋巴细胞、制成浓度为1．5×106／ml的细胞悬液。

③Hank液制备：见T细胞E－花环试验。

④RPMI－1640液：市售自制均可。自制，将RPMI－1640 20．8g溶于1 800ml蒸馏水中，将Hepes 11．915g溶于50ml蒸馏水中，两者混匀后，补足蒸馏水至1 920ml，过滤除菌，分装成100ml 1瓶，4℃保存备用。

方法

①取淋巴细胞悬液100μl，加入20孔U形底微量塑料板孔内，每份标本加4孔（对照、OKT3、OKT4、OKT8），然后以每分钟800转离心10s。

②去掉上清液，在细胞沉淀中，各孔分别加入OKT3、OKT4、OKT8、McAb各25μl（1∶25）稀释，对照孔加RPMI－1640液25μl，置4℃孵育30min。

③用Hank液洗涤3次（每分钟800转，10s），除去未结合的OKT McAb。

④各孔加5μl SAC－Ig悬液，置4℃30min后，用Hank液同上洗3次，洗去未结合的SACIg，最后各孔细胞分别用细胞离心机制片（每分钟500转，5min）。

⑤标本片经甲醇固定后，先经Wright液染色20min，再用Giemsa液染色20min后，镜检计数。

结果判断 细胞周围黏附4个以上葡萄球菌为阳性，数出SAC花环阳性的百分率。

参考值

T3：66．0%±9．9%

T4：43．8%±9．0%

T8：29．8%±7．3%

男性：T4／T8＝1．404±0．48

女性：T4／T8＝1．59±0．43

（2）直接红细胞花环法

原理 与SAC花环法相似，不同的是用抗人T细胞（MAcAb）致敏醛化红细胞。

试剂

①Hank液同T细胞E－花环试验。

②致敏红细胞悬液：市售。

③新生小牛血清市售。

方法

①常规分离外周血淋巴细胞，用含20%新生小牛血清的Hank液配成5×106／ml。将试管呈20°斜放，于37℃4min后，将非黏附细胞置另一试管备用。原试管弃去，以去除黏附细胞。

②根据待测标本数取一定量的致敏红细胞悬液，离心去上清。用含20%新生牛血清的Hank液悬浮，恢复至原量。

③淋巴细胞悬液与致敏红细胞悬液等量混合（各25μl），室温（22～25℃）下放置10min后，每分钟500转离心10min，室温下继续放置1h，4℃放置2h后，轻轻悬浮，以May－Gruenwald染色10min，弃去上清，再加等量Giemsa液染色30min，观察结果。

结果判断 用高倍镜检查淋巴细胞周围黏附有3个以上红细胞者即为阳性。计数100～200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率。

参考值 同SAC花环法。

（3）间接红细胞花环法

原理 与直接红细胞花环法相似，与之不同是用二抗（羊抗或兔抗小鼠TgG）致敏的红细胞悬液。

试剂 二抗（羊抗或兔抗小鼠IgG）致敏红细胞外，其余同直接法。

方法

①常规分离外周血中淋巴细胞，取25μl与单抗（一抗）等量混合25μl，4℃作用30min，再用含0．1%牛血清白蛋白（2%新生牛血清）的Hank液洗3次，去除未结合的单抗。

②加入用二抗致敏的红细胞悬液（处理方法同直接法）25μl，室温作用10min后，每分钟500转离心10min，室温下继续放置1h后，4℃2h或4℃过夜。

③染色：同直接红细胞花环接法。

结果判断 同直接红细胞花环法。

参考值 同SAC花环法。

2．间接免疫荧光法

（1）原理：受试者T细胞分别与淋巴细胞亚群特异性鼠抗人单抗混合孵育，表面带有某些亚群等异性抗原的T细胞与该亚群特异性的单抗结合，经荧光标记（异硫氰酸荧光素，FITC或罗丹明B200）的抗小鼠Ig的抗体（第2抗体）荧光染色，在紫外光激发下，发出荧光。

（2）试剂

①鼠型亚群特异性单抗生物制品所有售。

②荧光素标记的抗小鼠Ig的第2抗体。

③新生牛血清经人红细胞、白细胞吸收并灭活后备用。

④血清－Hank液按Hank液量加500ml／L上述新生牛血清。

（3）方法

①常规分离淋巴细胞，以血清Hank’s液洗涤后配成（2～3）×109／L，成活率不低于95%。

②上述待测细胞悬液中加入相应鼠型抗人T细胞亚群特异性单抗，37℃作用30min，用血清Hank液恢复成原浓度。

③加入荧光标记的抗小鼠Ig的第2抗体，37℃30min，再用血清Hank液洗涤3次，以洗去未结合的荧光抗体，最后用适量的血清Hank液将沉淀细胞悬匀。

④取1滴置载玻片上，盖上盖片，在荧光显微镜（最好用落射荧光显微镜）下，交替用白光和紫外光逐个检查每个淋巴细胞，计出荧光和不带荧光的细胞数算出荧光阳性细胞的百分率。

（4）结果判断：结合于细胞表面的荧光抗体，可呈点状散在．也可成簇分布，还可集中于细胞的一端呈帽状。凡在白光下认定是淋巴细胞，而在紫外光下又有荧光者，说明其具备与所用单抗相对应的抗体，根据抗原可确定淋巴细胞的群体或亚群。

（5）参考值：同SAC花环法。

（6）注意事项

①标记的荧光物质不同，在紫外光激发下，所发出荧光的颜色不同。如FITC发黄绿色，罗丹明B200发红光。

②洗液中加入小牛血清可保护细胞形态，但每次冲洗细胞所用洗涤液不宜过多，吹吸不宜过猛，否则，会造成细胞损失。

③进食、活动及不同时间采血等对T细胞亚群的结果无影响。

（7）临床意义：活动性结核患者外周血T3、T4细胞数减少，尤其是T4减少较显著，而T8细胞数增多，则T4／T8比值降低。且该比值老年结核患者较青年结核患者低，病变范围广者较病变范围小者低，痰菌阳性者较痰菌阴件者低，复治结核病患者也较初治结核病患者低。结核病患者外周血T4／T8R比值降低，可随化疗的进行而逐渐恢复正常。结核性胸（腹）膜炎患者胸腔积液（或腹水）T4／T8比值高于自身外周血，胸腔积液（或腹水）T3和T4绝对数高于其他性质的胸（腹）膜炎。

NTM病患者外周血T细胞亚群与结核病患者相似。

（三）自然杀伤细胞活性测定

自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）又称NK细胞，它产生细胞毒效应不依赖于抗体与补体，能直接杀伤多种靶细胞。NK细胞的测定常用核素稀释法。

1．原理 NK细胞可杀伤核素标记的靶细胞，使靶细胞内的核素释放，检测上清液中的核素释放率，即可计算出NK细胞活性。

2．试剂 标记靶细胞用慢性骨髓性白血病母细胞K562株作为靶细胞（可在液氮中长期保存）。取传代的K562株细胞4×106个／0．5ml加100μCi 51Cr－Na2CrO4，37℃1．5h（不是摇动），离心去上清游离的51Cr，调整其浓度为1×105个／ml。

3．方法

（1）常规分离待检外周血淋巴细胞。用RPMI－1640（见T细胞亚群检测）配制成5×106个／ml。

（2）自然杀伤管将待检细胞和标记的靶细胞各0．2ml，使待检细胞与靶细胞比率为（50～100）∶1。

（3）自然释放管RPMI－1640 0．2ml，标记靶细胞0．2ml。（4）最大释放管标记靶细胞0．2ml，20．0g／L SDS 0．2ml。

以上3管分别设3支复管，置37℃4h后，各管分别加入冷的Hank液0．6ml（终止反应），每分钟3 000转离心15min，各取0．5ml上清液，分别放入另外3支试管中，用γ计数仪计数各管的cpm。

4．结果判断

5．参考值 外周血，男性32%～71%，女性22%～63%。

6．注意事项

（1）标记的51 Cr浓度要合适，一般以4×106个／0．5ml细胞用100μCi 51Cr－Na2CrO4。如51Cr的放射性过低，标记率＜0．1cpm／细胞，则影响结果。

（2）待检细胞与靶细胞之比以1∶100为好，如果＞100，其自然杀伤率不再成对数增加，且标本用量较大。

（3）标记的靶细胞不宜放置过久，因随时间的延长，死细胞增加，自然释放率欠准确。

7．临床意义 活动性结核病患者外周血及结核性胸（腹）膜炎患者胸腔积液（或腹水）NK细胞活性增加，且在化疗期间可进一步增加，好转期患者NK细胞活性高于进展期患者，轻、中度患者NK细胞活性高于重症结核病患者，且NK细胞活性随病灶范围的缩小而趋于升高。因此，NK细胞活性测定对判断结核病的转归可能有一定意义。

二、细胞因子测定

（一）干扰素的测定

干扰素（interferon，IFN）是一种糖蛋白，由灭活或活病毒及干扰素诱导剂作用于易感细胞后所产生的。一种诱导剂所产生的干扰素，能抗御多种病毒甚至其他细胞内寄生的病原体（如MTB）的能力，因而亦属于非特异性免疫系统。

IFN对抗机体感染和调节细胞增殖与分化起着重要作用，正常机体可在无明显外来诱导物的情况下产生IFN。肺泡组织是机体长期暴露于外界环境最大的组织，但正常健康人血清和BALF中IFN－α平均含量分别为0和10．6U／ml，IFN－γ平均含量分别为0和0．227U／ml。由此可知，肺内IFN含量大大高于血清中的含量，表明IFN主要由肺内产生。多数人认为IFN－γ主要来自于肺泡隔的支气管黏膜组织中的T细胞，IFN－α主要来自于肺泡巨噬细胞和肺内的其他细胞。

目前测定IFN，主要有ELISA、微量常规检测法和固相放射免疫法（solid phase radioimmunoassay，SPRIA）等。

1．ELISA 参见有关试剂盒使用说明书。

2．微量常规检测法

（1）原理：将待检标本和细胞同时加入微量细胞培养孔内，细胞长成单层的同时得到IFN的保护，然后用病毒攻击。生长的活细胞可摄取一定浓度的活性染料（结晶紫），并使其着色，再将摄取染料的活性细胞及不摄取染料的死细胞于分光光度计或酶标比色计上测其吸光度，借此计算IFN的活力（效价）。

（2）试剂

①微量细胞培养板可采用40孔微量滴定板或进口的96孔微量培养板，处理方法如下，第一，置清洁液中浸泡过夜，然后用自来水冲净；第二，浸泡入1%HCl中，过夜后，经自来水冲洗干净；第三，用2%NaOH浸泡过夜后，自来水冲洗再经蒸馏水冲洗3次，37℃温箱烘干，临用前用紫外线照射1h后使用。

②测定细胞一般可选用人羊膜细胞WISH株，人胚肌皮或人胚肺细胞。

③攻击病毒一般选用水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）作为攻击病毒，使用前在预选定的细胞上滴定其50%组织培养感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）。由于VSV有“同步致病作用”，故以感染24h测定细胞出现“＋＋”（20%～25%的细胞出现病变）CPE的病毒稀释度的倍数乘以10（因微量滴定采用的量为0．11ml，故乘以10），单位TCID／ml。

④消化液取1%的胰酶5ml，加1%Versene 2ml，pH7．2PBS液（无钙、镁离子）至100ml（胰酶和Versene最终浓度分别为0．05和0．02）。

⑤培养基：Eagl最低限度培养基90%；灭活的小牛血清10%；青霉素、链霉素各250U／ml，最后用NaHCO3，调pH至7．2～7．4。

⑥维持液Eagl最低限度培养基95%，灭活的小牛血清5%，其余成分同营养培养基。

⑦结晶紫染液用于染羊膜细胞WISH株的配方：结晶紫0．8%，NaCl 0．85%（W／V）、50%乙醇（V／V）、3%甲醛（V／V）和46%蒸馏水（V／V）。

⑧脱色液：乙二醇甲醚（ethylene glycol monomethyl ether）50%，蒸馏水50%。

⑨1%Versetl溶液配制：EDTA 10．0g、NaCl 8．0g，KCl 0．2g，Na2HPO41．15g、KH2PO4 0．2g和葡萄糖0．2g溶于1 000ml无离子水中，此溶液pH为7．04。

（3）方法

①标本处理用营养培养基将标本作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32系列稀释，每一稀释度2管。

②每孔加入50μl IFN待检标本，加入顺序是从高稀释度到低稀释度。细胞对照孔和病毒对照孔内加50μl营养培养基。

③孔内加入50μl细胞悬液（加时尽可能用力，使细胞悬液入孔的冲力大，同时应不断摇匀瓶中细胞），IFN稀释度可提高1倍。

④悬液的配制选择健康的、3～4个月的引产胎儿，按一般方法制成原代单层培养物，待长成单层后（2～4d）。加入无钙、镁离子的PBS液（使细胞层充分浸泡即可），轻轻摇3～5次倒掉，再加入5倍量胰酶混合消化液于各细胞培养瓶中（无细胞层一面），将各瓶中的消化液立即翻向细胞层的一面，37℃消化10min，待细胞层出现“夏布纹孔状”时，即将消化液倒掉，再用Eagl培养基将细胞数调至（5～6）×106／ml，1ml分装，37℃24h后待用。

⑤于37℃培养24h，此时细胞已形成单层。

⑥将各孔内IFN倒掉，于各孔内加入100μl VSV（250TCID／50／ml），细胞对照加100μl营养基。

⑦37℃孵育，直到病毒对照孔的CPE75%以上为止（约36h）。

⑧弃去病毒液，将整块板浸入结晶紫染液中，染色15min。

⑨取出微板，流水冲洗残留染料后，用纱布将微板中的水吸干，各孔再加入200μl脱色液，置振荡器中振荡，加速脱色，脱色时问以染料完全从细胞中脱出为准。最后置酶标比色计上测吸光度（A）。

（4）计算（对数回归计算法）

y为IFN的保护的A值，x为IFN稀释度的倒数，B为回归系数，A为x＝1时y值，c为稀释倍数。

②举一例说明

（5）注意事项

①一定要先加IFN，然后加细胞，且加细胞冲力要大，这样细胞才能均匀地分布在凹孔的底面。

②加入细胞后，微板应放水平，不可摇动以免细胞堆积在一起。

③用同一批病毒作攻击病毒时，每次的稀释一定要准确，才能准时出结果（即病毒对照准时出现75%以上CPE），并使实验重复性好。

④微量细胞培养板的处理要严格，才能保证细胞良好生长，处理好的板子应注意无菌保存，尤其要防止真菌孢子落入凹孔内。

⑤应以IFN最终稀释度（原始稀释度×2）来计算效价，因为加入细胞悬液后，干扰素稀释倍数增加1倍。

（6）临床意义：参见下述SPPIA法。

3．SPPIA法

（1）原理：将已包被于聚苯乙烯小株抗人特异性TFN－γ特异性McAb与待检测标本中可能含有的IFN－γ结合，形成抗原抗体复合物，后者再与125I标记的鼠抗人IFN－γ抗体（第2抗体）结合，形成抗体－抗原抗体免疫复合物，经γ计数仪测定小株上积存之CPM，并与阴性、标准品相比较，即可测出标本中IFN－γ的含量。

（2）试剂：国外有试剂盒出售，试剂盒中包括以下3种。

①鼠抗人IFN－γ的特异性McAb包被聚苯乙烯株。

②125I标记鼠抗人IFN－γ抗体（第2抗体）。

③标准品。

（3）方法

①试管中加入鼠抗人IFN－γ的特异性McAb包被的聚苯乙烯珠1枚，再加入待检标本（血清、胸腔积液、腹水等）20μl，同时作阴性对照和标准品，37℃2h孵育后，IFN－γ结合于聚苯乙烯株上，再以洗液洗涤2次。

②加入125I标记的鼠抗人IFN－γ抗体200μl，37℃孵育2h，同上洗涤2次。

③测各管聚苯乙烯株的放射性活性，与不同标准IFN－γ相比较，可求出待测标本IFN－γ的含量。

（4）参考值：血清IFN－γ＜1U／ml。

（5）方法学评价：该法灵敏高，能检出IFN－γ的最低限量为0．1U／ml，特异性高，只能检出IFN－γ，不能检出IFN－α和IFN－β。

（6）临床意义：结核性胸膜炎患者胸腔积液中IFN－γ含量升高，＞2U／ml，而非结核性胸腔积液（癌性、类肺炎后胸腔积液漏出液）均低于2U／ml，但结核性胸膜炎患者血清含量并不升高。结核性胸腔积液中IFN－γ含量与胸腔积液量呈正相关，即胸腔积液量越多，则IFN－γ含量越高，且肺内有病变者较肺内无病变者胸腔积液IFN－γ含量高。由此可知，胸腔积液内检测IFN－γ含量是诊断结核性胸膜炎敏感性和特异性都很高的一个试验。

（二）1，25－二羟维生素D3测定

1，25（OH）2D3是维生素D的主要活性形式。早年人们认为它是一种调节钙、磷代谢的激素，只有肝和肾才是其生成的器官。但随着人们对其研究的深入，发现除肾脏具有1α羟化酶外，单核细胞、巨噬细胞等均可产生1α－羟化酶，生成1，25（OH）2D3。1，25（OH）2D3除具有上述功能外，还可具有免疫调节作用，在抗MTB感染中起着重要的作用。

1，25（OH）2D3测定方法有放射受体法（radioreceptor assay，RRA）、HPLC法和离子择电极法（selected ionmonitoring，SIM）。下面介绍RRA法。

1．原理 于反应混合物中加入含1，25（OH）2D3的标本和3 H标记的1，25（OH）2D3，竞争性与受体蛋白结合，经过一定时间反应后，测定上清液放射性活性，即可得出标本中1，25（OH）2D3的含量。

2．试剂

（1）受体蛋白的制备：耳静脉注射空气处死家兔，立即从十二指肠切下小肠约50cm，放入冰冷的26mmol／L pH 7．4PBS缓冲液中，并以此缓冲液冲洗肠腔3次，以除去内容物。然后，纵向剪开小肠，刮下黏膜层。将收集的黏膜剪碎，加入2倍体积的PBS缓冲液（26mmol／L pH 7．4，内含5mmol／L二硫苏糖醇，1mmol／L EDTA，10mmol／L Na2MO4和0．3mmol／L KCl），用玻璃匀浆器制成匀浆，将此匀浆每分钟17 000转离心4h。收集上清分装，－70℃冰箱保存备用，可保存1个月活性不变，受体蛋白质含量以双缩脲法测定，用牛血清蛋白为标准。

（2）3 H－1，25（OH）2D3：将3 H－1．25（OH）2D3溶于异丙醇中（约6 000cpm）。

（3）标准液含1，25（OH）2D3分别为1pg、5pg、25pg、50pg、100pg和200pg。

（4）Dextran T－70。

（5）活性炭。

（6）二氧六环闪烁液。

3．方法

（1）待检标本：1，25（OH）2D3的提取，2ml血清加26，27－甲基3 H－1，25（OH）2D3，经涡旋混匀后，置室温平衡15min，加10ml二乙醚混合30min，冷冻于丙酮中，倾出醚相，再重复二乙醚提取1次，在液氮中蒸发醚相干燥，剩余物溶于1ml乙腈、0．6ml H2O、0．4mol／L K2HPO4（pH10．6）0．4ml，涡旋混匀后装C－18Sep Pak柱，用5ml蒸馏水洗脱，再用3ml甲醇洗脱，最后用5ml乙腈洗脱维生素D代谢物，于流动的液氮中干燥，再溶于乙烷一异丙醇（99∶1）中，装二氧化硅Sep－Pak柱，先用4ml乙烷异丙醇（95∶5）洗脱25（OH）D，再用8ml乙烷异丙醇（93∶7）洗脱24，25（OH）2D，最后用10ml乙烷异丙醇（85∶15）洗脱1，25（OH）2D3进行RRA试验。

（2）于反应管中加入溶于异丙醇的3 H－1，25（OH）2D3（约6 000cpm）和不同浓度的标准1，25（OH）2D3及标本各50μl，受体蛋白1ml（2．8mg／ml），混匀后于25℃水浴1h，然后将反应管移入冰水中终止反应。再向各管中加入Dextran T－70覆盖活性炭250μl，冰浴中静止10min后，于每分钟3 500转离心10min（4℃），吸取上清液各1ml，用二氧六环闪烁计数仪计数。

4．结果判断 以标准1，25（OH）2D3含量为横坐标，以与受体蛋白结合百分率为纵坐标，绘成标准曲线。从已知待测标本的结合百分率，在标准曲线上可查出标本中1，25（OH）2D3含量。

5．参考值 血清（37．1±12．1）pg／ml。

6．临床意义

（1）血清中1，25（OH）2D3含量升高，导致高钙血症。

（2）血清中1，25（OH）2D3含量降低，可增加机体对MTB的易感性，同时，机体对MTB的免疫力下降。当1，25（OH）2D3含量达10～90mol／L时，能抑制MTB生长。

（三）白细胞介素－2受体测定

白细胞介素－2受体（interleukin 2receptor，IL－2R）是由α、β两条肽链组成的糖蛋白，分子量为45 000。T细胞受体被有丝分裂原刺激后4h内，开始表达IL－2R，2d后升至高峰，5～6d开始下降。正常健康人在生理性刺激后，活化淋巴细胞释放IL－2R，血清IL－2R含量为100～500U／ml（以PHA刺激淋巴细胞产生的标准单位计算，平均250U／ml）。MTB感染时，由于巨噬细胞对MTh抗原作用，T细胞被活化，致敏的T细胞增殖，释放IL－2R。

血清中IL－2R含量以ELISA法应用最为广泛。国外已有试剂出售，试剂盒中含：①重组DNA纯化的IL－2R；②异硫氰酸连接的抗IL－2R抗体TG7／TG6；③碱化磷酸酶连接的兔抗FIFC；④底物溶液。ELISA法有竞争性ELISA法和夹心ELISA法，前者较后者敏感，最小检出量可达31U／ml。

Brown测定了12例肺结核、8例肺外结核及健康人血清IL－2R含量，结果肺结核和肺外结核患者血清IL－2R含量均超过487U／ml（正常参考值IL－2RR含量＜400U／ml），肺外结核有低于肺结核的趋势。

Ito检测了10例结核性胸膜炎、10例肺癌和8例漏出性胸腔积液患者的血清IL－2R含量，结核性胸膜炎患者胸腔积液IL－2R含量明显高于肺癌胸腔积液IL－2R量，凡结核性胸膜炎患者胸腔积液／血清IL－2R之比＞1，其他性质胸腔积液该比值均＜1。

由此可得：①IL－2R可作为诊断活动性结核病的免疫学指标；②能从淋巴因子水平掌握结核病的病情；③IL－2R还可反映机体细胞免疫状况。

（四）白细胞介素－2检测

白细胞介素－2（interleukin－2，IL－2）是一种主要由Th细胞产生的淋巴因子，能使免疫活性细胞（T细胞、B细胞、NK细胞等）保持长期增殖，增强细胞介导的或自然杀伤的细胞毒效应，通过激活淋巴细胞而增强杀伤细胞活性。IL－2作为免疫系统中的一种传递因子作用于T细胞、B细胞等淋巴细胞参与免疫应答和细胞免疫反应。目前，测定IL－2常用ELISA、3 H－TdR掺入法，此外，还可用比色法。

1．ELISA 参见有关试剂盒使用说明书。

2．3 H－TdR掺入法

（1）原理：人外周血淋巴细胞经PHA刺激后可产生IL－2，而IL－2能支持体外培养T细胞的生长。据待检标本含IL－2在何种稀释度时仍能支持细胞生长（细胞生长程度可借。3 H－TdR掺入量来测定），即可得知IL－2的活性。

（2）试剂

①AB型人血清。

②RPMI－1640液（见T细胞亚群检测）。

③PHA。

④新生小牛血清。

⑤正常人外周淋巴细胞。

⑥3 H胸腺嘧啶核苷（3 H－TdR）。

（3）方法

①常规分离外周血淋巴细胞，用含2%AB型人血清的RPMI－1640液配成1×109／L细胞悬液。

②IL－2诱生：将待检者外周血淋巴细胞液加入最终浓度为300～400mg／L的PHA，置24孔培养板孔中，每孔1．5ml。于37℃环境中培养40h，吸出培养液，离心除去细胞碎片，上清液4℃保存待检。

③IL－2依赖细胞制备：用正常人外周血淋巴细胞以含2GAB型人血清的RPMI－1640培养液配成1×109／L细胞悬液，每1ml加入300μg PHA。于24孔培养板中每孔加上述细胞悬液1．5ml，于5%CO2环境中37℃培养40h，吸出上清培养液（其中含IL－2），孔中经PHA活化的淋巴细胞以含上清（有IL－2）的100ml／L小牛血清－RPMI－1640培养液传代培养12d。12d后细胞对PHA反应很弱，需IL－2维持生长，即可作为IL－2活性测定的依赖细胞。

④IL－2活性测定：用RPMI－1640液洗IL－2依赖细胞2次，除去残余IL－2。再悬于2%AB型人血清RPMI－1640中，使成2×108／L悬液，于96孔培养板上每孔加0．1ml，再加倍比系列稀释的待检标本0．1ml，于5%CO2环境中37℃培养54h，每孔加。3 H－TdR 0．5μCi，继续培养18h。将各孔培养物收集于9999型玻璃纤维滤纸上，用2ml生理盐水洗2次。用5ml 100g／L三氯醋酸固定，最后用3ml无水乙醇脱水。将滤纸取下，80℃烤干，置入闪烁液中在闪烁仪上测cpm值。

（4）结果判断：能够使3 H－TdR掺入最多的IL－2最高稀释度为1U。

（5）参考值：正常人外周血淋巴细胞IL－2为123U。

（6）临床意义：参见MTT比色法。

3．MTT比色法

（1）原理：MTT［3－（4，5－dimethylthia 20l－2－yl）－2，5－diphenyl）tetrazolium bromide］是一种黄色可溶性复合物，易被活细胞吸收，在活细胞线粒体水解酶的作用下，转化为紫蓝色不溶性甲（formazan），沉积于细胞内或细胞周围。甲的形成量与细胞增殖相关，因而测得吸光度（A）与IL－2呈正相关。

（2）试剂

①称取MTT 50mg，溶于10ml 0．01mol／L pH 7．4PBS中，溶解后经过滤除菌，4℃避光保存。

②0．04mol／L HCl—异丙醇：取300ml异丙醇加1ml浓HCl即可。

③细胞培养：加入含IL－2待测标本，37℃培养40h，培养板每分钟2 000转离心15min，从各孔中轻轻吸取0．1ml（孔内原有0．2ml液体）培养上清，再于各孔中加入1μl MTT溶液，37℃培养4～6h后再向各孔中加入0．1酸化异丙醇，充分混匀，静置10min，待细胞代谢MTT形成的甲充分溶解，用酶标检测仪570nm测吸光度。

（3）结果观察：各实验室测一定数量正常人，以结果吸光度的x±2SD为正常参考值，确定正常范围。

（4）参考值：见结果观察。

（5）注意事项：操作中应注意，加入酸化异丙醇后要在1h内进行测定。若1h内来不及测定，可将未加酸化异丙醇的培养板置4℃保存，测定前取出，室温置数分钟后，再加酸化异丙醇，依照上述方法测定。

（6）临床意义：活动性结核患者IL－2生成减少，血清IL－2活性降低，但IL－2表达是否直接影响IL－2的生成尚无一致意见。

（五）其他

与结核病相关的细胞因子尚有肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、IL－4、IL－8、TGF－β及一些白细胞分化抗原，其检测方法多为ELISA，具体见试剂盒说明书。

三、细胞凋亡测定

（一）细胞凋亡

人体内的细胞都经历各自特定的细胞生命过程，包含细胞的增殖、分化和凋亡。凋亡是由内在基因调控的一种细胞死亡方式，在胚胎形成、组织发生。有关细胞发生发展等生理病理过程无不涉及凋亡。人体内的细胞注定是要死亡的，有些是生理性的死亡，有些则是病理性的死亡，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为止，人们已经知道细胞的死亡有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。

凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl－2家族、caspase家族、癌基因如C－myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。

（二）细胞凋亡检测

1．早期检测

（1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测。

（2）细胞内氧化还原状态改变的检测。

（3）细胞色素C的定位检测。

（4）线粒体膜电位变化的检测。

2．晚期检测 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180～200bp的DNA片段。对于晚期检测通常有以下方法。

（1）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）。

（2）LM－PCR ladder（连接介导的PCR检测）。

（3）Telomerase Detection（端粒酶检测）。

3．生化检测

（1）典型的生化特征：DNA片段化。

（2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等。

（3）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP（多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’－OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、甲醛固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

4．LM－PCR Ladder 连接介导的PCR检测。当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM－PCR，连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM－PCR检测是半定量的，因此，相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P－ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其他损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其他原因的干扰，需结合其他的方法来检测细胞凋亡。比如端粒酶检测和mRNA水平的检测。

端粒酶检测，端粒酶是由RNA和蛋白质组成，它可以自身RNA为模板反转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂1次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。

mRNA水平的检测，研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。bcl－2和bcl－X（长的）作为抗凋亡（bcl－2和bcl－X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas，bax－alpha和bcl－X（长的）基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

5．细胞内氧化还原状态改变的检测 正常状态下，谷胱甘肽（GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

（三）形态学观察

1．普通光镜下观察

（1）用苏木素－伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞质呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。

（2）Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色。

2．直接用倒置显微镜观察

（1）细胞体积变小，全面皱缩。

（2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。

3．透射电子显微镜观察

（1）凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

（2）细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为3期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

4．荧光显微镜

（1）常用的荧光染料：吖啶橙、PI、DAPI、Hoechst 33258和Hoechst 33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI 3种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A－T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

（2）PI双染色法基本原理：Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大的细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin－V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。