结核病体液免疫学测定

一、特异性抗体测定

MTB菌体抗原能刺激机体B细胞分化增殖成浆细胞，再由浆细胞产生特异性抗体。许多研究已表明，活动性结核病患者血清、胸腔积液（或腹水）、CSF和心包积液等出现一定量的特异性抗体。迄今为止，虽未证实此特异性抗体具有保护作用（MTB为细胞内寄生菌），但利用体内特异性抗体的测定可鉴别诊断活动性结核病与陈旧性结核，随访活动性结核病的抗结核治疗效果，监测BCG的免疫效果。

特异性抗体的测定方法较多，有被动血凝试验、反向间接血凝抑制试验、ELISA法、ELISA抑制试验、亲和素－生物素酶联免疫吸附试验、固相放射免疫试验、金标法检测结核抗体诊断药盒等。

（一）被动血凝试验

1．原理 被动血凝试验（passive haemagglutination assay，PHA）即将可溶性抗原预先吸附在一种与免疫无关的颗粒状物质一载体颗粒的表面，然后再与相应的抗体作用，即可呈现凝集现象。载体颗粒的凝集是由于其表面所吸附的抗原和相应抗体相互结合而造成的，故称被动凝集。可以作为载体颗粒出现凝集反应的物质主要有O型人的红细胞、绵羊和家兔的红细胞，因此称被动血凝。此外，聚苯乙烯胶乳颗粒以及活性炭颗粒等亦可作载体。

红细胞作载体颗粒，较容易与多糖类抗原相吸附。若用鞣酸处理红细胞，还能与蛋白质抗原相吸附。若用甲醛、戊二醛等将红细胞醛化，再进一步冷冻干燥，就更容易保存。

2．试剂

（1）抗原的制备：MTB（H37Rv）培养于Sauton培养基6周后，微孔过滤，以丙酮杀死H37Rv，然后用pH7．2PBS缓冲液洗涤3次，再悬浮于上述PBS缓冲液中，最终浓度为2mg／ml（湿重）。悬浮液在低温下经超声粉碎机粉碎5min后，每分钟5 000转离心20min，以Loery法测定蛋白质含量，－40℃保存。

（2）致敏醛化SRBC制备：取羊血于抗凝血药中，4℃24h，用pH7．2PBS缓冲液洗涤3次后，以pH7．2PBS缓冲液配成50%红细胞悬液。取10份红细胞悬液加4份丙酮醛溶液（丙酮醛溶液含12份1．7%NaCl、35份10%Na2CO3、7份pH8．0PBS缓冲液），4℃24h（经常摇匀），再用上述PBS缓冲液洗涤3次后，配成2．5%红细胞悬液。取2．5%悬液与体积1∶2 500鞣酸（冷PBS配制）混匀，4℃30min，此时红细胞成褐色，再以PBS洗1次，用PBS配成4%悬液，与等体积戊二醛（2%）混匀，置室温2h后，以PBS洗涤3次，再用PBS液配成50%的红细胞悬液，加入0．1%NaN3防腐，4℃保存。将上述50%红细胞悬液以PBS缓冲液（0．067mol／L pH6．4含0．8%NaCl）洗3次，再用pH6．4PBS液配成10%红细胞悬液后，加入适量抗原（1．2mg蛋白质／ml），37℃水浴6h，随后4℃18h，再将此致敏的红细胞用PBS洗涤1次，用含0．1%牛血清白蛋白PBS缓冲液洗涤2次，再稀释成1%的红细胞悬液备用。

3．方法

（1）先将微量反应板第1孔内用微量加样器加入生理盐水75μl，其余各孔各加25μl。

（2）用稀释棒蘸取被检标本2μl（只需将稀释棒头部整个都浸入血清内）加入第1孔内，如此连续稀释至最后1孔。标本稀释倍数依次为1∶4，1∶8，1∶16……

（3）用微量加样器加15μl致敏醛化红细胞悬液于各孔内。

（4）振荡混匀（约2min），再置37℃或室温1～2h后，观察结果。每次测定样品都应同时做阴性、阳性对照。

4．结果判断

（1）红细胞有孔底形成厚边圆形，周围有少量红细胞凝集者为＋。

（2）红细胞有孔底凝集成较大的薄环者为＋＋。

（3）红细胞平铺孔底，周围出现皱褶者为＋＋＋。

（4）红细胞平铺孔底，凝成均匀薄层为＋＋＋＋。

以呈现＋＋凝集者为判定终点。以1∶64或以上呈现＋＋为阳性。

5．参考值 正常健康人血清凝集效价＜1∶64。

（二）反向间接血凝抑制试验

1．原理 将待检标本与已知一定含量的MTB抗原（如Ag5、PPD）作用，如果待检标本中含有相应的抗体，抗原抗体即发生特异性结合。再加入MTB单克隆抗体致敏的羊红细胞（O型人红细胞），即不发生凝集；若待检标本中无相应的抗体，加入的抗原即与抗MTB的单克隆抗体致敏的羊红细胞（O型人红细胞）发生特异性结合，借助于红细胞的凝集现象判断结果。

2．试剂

（1）醛化红细胞同PHA法。

（2）致敏红细胞的制备：SPA—Sepharose CL－4B（上海生物制品所产品）1．5g，以pH7．4PBS溶解后装柱。杂交瘤腹水2ml以PBS稀释l倍，经1层尼龙布过滤后加入柱床滞留2h以上。然后以PBS洗去未结合的血清组分。再以pH2．8的0．1mol／L甘氨酸盐酸液洗脱IgG，一般前3ml无蛋白质，尔后的10ml可将所有IgG洗下，经PBS透析浓缩保存。待用时稀释至100μg蛋白质／ml，在pH4．0醋酸盐缓冲液中致敏双醛化人红血细胞（Rh阳性，O型）。即得“MTB单克隆抗体致敏人红细胞”备用。

3．方法

（1）将PPD以中性生理盐水稀释至0．3mg／ml，于微量血凝板上以稀释棒用2%小牛血清盐水稀释6孔。

（2）每孔加1∶5的稀释标本1滴，对照孔加生理盐水1滴，37℃15min。

（3）每孔再加“MTB单抗致敏人红细胞”l滴，37℃1h后观察结果（凝集效价）。

4．结果判断 同PHA法。

5．参考值 1∶80以上凝集者为阳性。正常健康人和非结核病患者为阴性。约80%的结核病患者血清为阳性。

（三）ELISA法

1．特异性IgG的测定

（1）原理：将纯化蛋白衍生物（PPD）、聚合OT、盐水提取物、Ag5和BCG等吸附于聚苯乙烯塑料板小孔内，致敏的小孔内加入待检标本，经一定时间孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，以洗涤除去多余抗体成分。然后，加入酶标记的抗球蛋白结合物（酶标羊抗人IgG等），与吸附在固相表面的抗原抗体复合物结合，再加入酶的底物，在酶标比色计测定其吸光度，从而得知标本中抗MTB抗体含量。

（2）试剂

①包被液、洗涤液和底物缓冲液。

②底物溶液：邻苯二胺（O－phenylenediamine）40mg溶于100ml底物缓冲液中，临用前加30%H2O20．15ml。

③辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体将兔抗人或羊抗人IgG的7球蛋白组分用改良过碘酸钠法制备与辣根过氧化物酶（HRP）的结合物。最适工作浓度经方阵滴定测试。

④抗原

a．PPD：可自北京中国药品生物鉴定所购买。经方阵滴定选择最佳浓度，一般以10～20μg／ml浓度包被。

b．聚合OT：取浓缩的旧结核菌素4ml，经0．1mol／L pH5．6醋酸盐缓冲液中透析过夜后，用0．1mol／L盐酸调pH至5．2，加氯甲酸乙酯0．5ml，并用0．1mol／L NaOH调pH至5．2，当pH稳定在5．2时，聚合即完毕；然后，每分钟3 000转离心15min，取上清液经方阵滴定确定试验用最佳稀释度。一般以蛋白质最终含量为5～10μg／ml为佳。

c．BCG：经方阵滴后使用，一般浓度为20μg／ml。

d．MTB的超声提取物：见PHA法。

e．MTB抗原5（Ag5）：是MTB胞质中蛋白质成分。于1978年由美国Daniel等首先分离、纯化和鉴定，经改良免疫电泳证实，只有MTB和牛结核分枝杆菌具有此抗原。一般以10μg／ml包被试验用。

（3）方法

①将抗原用包被液稀释成最适浓度（10～20μg／ml）包被反应微孔，每孔0．1ml。43℃1h（或37℃2h，4℃过夜）。

②将反应板经洗涤液3×3min洗涤后，每份待检标本（血清、胸腔积液、腹水和CSF分别做1∶100，1∶10和1∶2稀释）0．1ml 43℃30min或37℃1h后，经洗涤液3×3min洗涤。

③加最适工作浓度的HRP标记的抗人IgG抗体，每孔0．1ml，43℃15min或37℃30min，经洗涤液3×3min洗涤。

④每次取新配制的底物溶液0．1ml，43℃10min或37℃20min显色后，用1mol／L H2SO4 0．1ml终止反应。以酶标比色计492nm测各孔吸光度。每反应板以试剂空A调零，并设阳性和阴性血清做质量控制。每份标本做复孔，以复孔的平均吸光度值为结果。

（4）结果判断：P／N值≥2．1为阳性。若采用目视比色，则高于阴性孔，与阳性孔相当即为阳性，否则为阴性。

2．特异性IgA和IgM测定 原理试剂、方法和结果判断均与特异性Ig测定一样，不同的是方法③中的加最适用浓度的HRP标记的抗人IgG抗体改为加最适用浓度的HRP标记的抗人IgA或HRP标记的抗人IgM。若将HRP标记的抗人IgG抗体改用最适工作浓度的HRP－SPA，除能测出特异性IgG1、IgG2和IgG4外，还能测出能与SPA结合的IgA、占IgA的40%～50%，且结核患者体内特异性IgA的含量升高仅次于特异性IgG，因此，用HRP－SPA进行ELISA试验时的阳性率高于HRP标记的羊抗人IgG抗体进行ELISA试验的阳性率。

（四）ELISA抑制试验

1．原理 与ELISA基本上相同，不同之处是标本与酶标抗体同加入反应板，其结果用抑制度表示。

2．试剂

（1）酶标单克隆抗体将MTB单克隆抗体的腹水混合，用SPA－Sepharose提纯，再用过碘酸盐法标记辣根过氧化物酶。

（2）其他试剂同ELISA法。

3．方法

（1）包被以PPD作抗原，预先经方阵滴定法选择最佳浓度（10～20μg／ml）抗原，经pH9．6碳酸盐缓冲液稀释后，每孔包被0．1ml，37℃1min或4℃过夜，经pH7．4PBS洗涤3×3min。

（2）各孔以20%小牛血清0．1ml阻断余位，37℃30min后，同上洗涤。

（3）每孔加待检标本（血清不稀释）0．1ml，每一标本重复2孔。对照孔加生理盐水0．1ml，37℃10min后甩干，但不必洗涤。

（4）每孔加入适当稀释（预先经方阵滴定确定）的酶标纯化混合MTB单克隆抗体1滴，37℃10min后，同上洗涤。

（5）每孔加底物溶液0．1ml，37℃30min后，以1mol／LH2SO420μl终止反应。492nm测其吸光度（A）值。

4．结果判断

5．参考值 正常健康人其抑制度＜50%。而80%以上的结核病患者其抑制度＞50%。

（五）亲和素－生物素酶联免疫吸附试验（avidin－biotin－peroxdase－complex－ELISA，ABC ELISA）

1．原理 预先按一定比例将亲和素与酶标生物素共温形成ABC，当ABC与生物素化抗体接触时，ABC中尚未饱和的亲和素结合部位可与抗体分子上的生物素结合，从而把抗原抗体反应体系与ABC标记体达到检测目的。在形成ABC过程中，1个酶分子可通过其生物素连接多个亲和素，而1个亲和素分子又可桥联多个酶标生物素，从而产生网络结构，罗织了大量的酶分子。也就是说，ABC复合物可使酶在抗原抗体反应体系中的浓度大大增加，提高了测试系统的灵敏度。据报道，ABC ELISA法较ELISA法的灵敏度高4～16倍。

试验时将MTB抗原包被在聚苯乙烯反应板上，洗涤过剩的抗原物质，将待检标本加到致敏的载体上，使用抗原抗体生物素化抗人IgG复合物，再加入生物素酶结合物，使其与上述复合物结合成了抗原亲和素—抗体—生物素化抗人IgG亲和素，最后经催化底物显色。反应颜色的深浅与标本中相应抗体含量成正比。

2．试剂

（1）抗原同ELISA法。

（2）包被液、洗涤液、酶底物溶液和终止液同ELISA法。

（3）生物素化抗人IgG有商品供应，使用时按效价稀释。

（4）ABC有商品供应，使用时按效价稀释。

3．方法

（1）包被：将抗原用0．05mol／L pH9．6碳酸盐缓冲液稀释至最适浓度（经方阵滴定确定，若是PPD，一般为10μg／ml），取0．1ml加入反应板的各孔内，4℃过夜，以洗涤液3×3min洗涤。

（2）用稀释液将标本稀释至最适浓度（血清做1∶100稀释），每份标本加2孔，每孔0．1ml，并设阴性、阳性对照。37℃1h，同上洗涤。

（3）将生物素化抗人IgG按工作浓度稀释，每孔0．1ml，置37℃1h，同上洗涤。

（4）每孔加0．1ml ABC复合物，37℃30min后．同上洗涤。

（5）每孔加酶底物0．1ml，37℃显色15min，以1mol／L H2SO4终止反应。

4．结果判断 经酶标比色计492nm比色，以试剂空白调零后比色。以P／N值≥2．1者为结核分枝杆菌抗体阳性，反之为阴性。

5．参考值 正常健康人为阴性，P／N值＜2．1。

（六）固相放射免疫试验

1．原理 固相放射免疫试验（solid phase radio immnuo assay，SPRIA）与ELISA法基本上相似。不同的是以125I－SPA代替酶标羊抗人IgG，以测CCP值代替吸光度A值。

2．试剂

（1）PPD或其他MTB抗原。

（2）PA的放射性碘标记：自制可用氯胺T氧化法，也可从生物制品所购买。

3．方法

（1）将抗原（如PPD）经包被液稀释至10～15μg／ml浓度，包被于固相载体板上，每孔0．2ml，4℃过夜。用洗涤液3×3min洗涤。

（2）每孔加入待测标本（血清1∶100稀释）0．2ml，同时设阴性、阳性对照，每份标本做2孔。4℃过夜后洗涤3×3min。

（3）每孔加125I－SPA 0．2ml，45℃水浴1．5h后，同上洗涤。掰开固相载体条，按编号置入清洁塑料试管中，以计数仪测其CCP值。

4．结果判断 以标本管中放射性计数（P）与抗PPD阴性对照管计数（N）之比来判断抗PPD抗体之阳性和阴性。当P／N≥2．1为阳性，反之为阴性。若测抗体效价，可将标本连续倍比稀释，以能达到P／N值≥2．1时之最高稀释度的倒数为抗体效价。

5．参考值 正常健康人为阴性，P／N值＜2．1。

（七）金标法检测结核抗体诊断药盒

20世纪90年代初cHuN等提出用胶体金代替酶作为标记物用于斑点金免疫渗滤试验（dot immuno gold filtration assay，DIGFA），并成功地应用于临床HIV、HCG、AFP等测定。

由于胶体金本身为红色，不需引入底物显色试剂，阳性反应即出现红色斑点，同时反应省却了37℃孵育等步骤，具有快速、简便等优点，得到临床广泛应用，检测仅需数分钟，其敏感度接近于ELISA方法。

金标法检测结核抗体（DIGFA TB－Ab）其抗原多用基因工程的MTB膜抗原，点样于硝酸纤维膜，运用间接法原理检测结核抗体，全程操作仅3～10min，是目前世界上结核病诊断最快捷的方法。

1．试验方法

（1）封闭。

（2）加样。

（3）洗涤。

（4）加胶体金标记的抗原。

（5）洗涤。

（6）观察显色结果。

2．操作步骤

（1）封闭加2滴封闭液于反应板，待完全渗入。

（2）加样加40μl新鲜血清标本，待完全渗入。

（3）洗涤加6滴洗涤液，待渗入。

（4）加胶体金标记的抗原加2滴金标抗原，待完全渗入。

（5）洗涤加6滴洗涤液，待渗入。

3．结果判断 阳性，小孔中央有红色斑点；阴性，小孔中央无红色斑点或仅痕迹。

4．参考值 正常人为阴性，小孔中央无红色斑点或仅痕迹。

5．注意事项 虽然金标法诊断药盒操作简便，但必须严格按照操作说明，才能得到满意的结果。

（1）必须使用新鲜的血清标本。才能得到最准确报告。新鲜标本可保证不受污染影响，效价不会降低。血浆标本必须剥离纤维蛋白，以免造成膜孔堵塞，导致背景偏红。

（2）在标本冷藏的特殊情况下，临用时必须融化后，离心去除沉淀，轻取上清液试验。若标本较长时间不用，置20℃以下，冷冻保存。

（3）标本操作应连续进行，必须单人份操作。由于使用原倍血清，未经稀释，为避免膜杂蛋白造成封闭过度，导致膜干燥、渗滤受阻，因此，各项操作步骤应于溶液渗干后即连续进行，不宜停顿，以保证试验结果的准确性。

（4）阳性结果判读为中央点为明显红色圆点，洗涤不褪色，阴性结果判读为中央点为白色圆点或仅痕迹或洗涤下非特异性显色褪尽。

（5）少量特殊标本（急性感染、高血脂、溶血等）出现背景微红，不影响结果判读，可通过将标本用封闭液1∶4稀释，加样100μl获得改善，背景变为白色。

（6）加液时应垂直连续滴，保证加样的准确性，吸管不要接触反应膜，以免划破膜表面，各操作应严格标准化，次序不得混淆。

（7）各滴瓶溶液，使用后立即旋紧瓶盖，滴管尽量缩短与外界接触，保证溶液免受污染。

（8）试剂一般保存于2～8℃干燥环境，若溶液渗入速度极缓（超过2min）表明硝酸纤维膜受潮，结果将受严重影响。

（八）测定特异性抗体的方法学评价

特异性抗体测定的研究与应用，经历了一个漫长阶段。最先由Terchmann于1964年用非特异性脂蛋白沉淀物测定结核抗体，直到20世纪80年代初期才开始应用于临床，纵观其原因，大致有，①MTB抗体测定特异性不高，抗原难纯化；②结核患者体内抗MTB抗体水平差异较大；③此类抗体与类风湿因子等有交叉；④需更灵敏的检测方法。

1．MTB抗原的选择

（1）MTB蛋白抗原：MTh蛋白抗原是结核病特异性抗体测定中应用最广的一类，主要有4种，①粗提MTB蛋白（OT、菌体超声粉碎后的离心物）；②沉淀MTB蛋白（PPD等）；③纯化MTB菌蛋白（Ag5等）；④基因工程重组抗原。

MTB蛋白抗原共同缺点足抗原性不一致，与其免疫血清进行双相扩散可见多条沉淀线，与其他分枝杆菌也有明显交叉，从而影响试验的特异性。经对流免疫电泳证实MTB可溶性抗原含42种以上抗原成分，而PPD只含4种，因此，PPD进行血清学反应其特异性比可溶性抗原好，见表4－1。

抗原5（Ag5）系Daniel用免疫吸附亲和层析法从H37Rv株培养滤液中纯化出来，已证实只有MTB和牛结核分枝杆菌共有。经分析Ag5含蛋白质5μg／ml，己糖0．7μg／ml和戊糖0．1μg／ml，故命名为Ag5。用Ag5做皮试特异性不高，但一般认为做ELISA特异性较高，可达90%以上。现临床上以基因工程重组抗原多见。

（2）多肽抗原MTB：多糖抗原的基本组成单位是阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等，而多糖又与类脂组成复合物，多存在于细菌胞壁上。多糖也与蛋白A和多肽结合存在于MTB菌体中。无论是糖蛋白还是糖脂，都具有抗原性。如分枝杆菌富含阿拉伯甘露糖（LAM），此抗原能诱发宿主产生相应抗体，但不激发迟发型超敏反应，不产生保护性免疫，因此，主要用于血清学诊断。但由于LAM和阿拉伯半乳糖的抗原决定簇与其他分枝杆菌、诺卡菌、棒状杆菌和李斯特杆菌（Listeria）有共同抗原，这种抗原交叉，不但使检测特异性不高，也使其纯化困难。由于不同的蛋白质分子内部有相同糖基时，则具有共同抗原性。但MTB抗原所致假阳性，并非多糖单一因素所致，与脂类和蛋白质也有关。

表4－1 不同抗原及方法测定特异性抗体比较

（3）菌体和细胞壁抗原：此抗原可从新近诊断为肺结核患者的痰中分离菌株制备。MTB经培养增殖后加热灭活，离心洗涤，取沉淀冻干即为完整的菌体抗原。再将完整的菌体抗原与等量玻璃珠（直径为0．5mm）混合，用匀浆器处理，再分离收集细胞壁。重复洗涤离心，取沉淀冻干即成细胞壁抗原。上述2种抗原已用于RIA检测MTB抗体。BCG用作抗原与此相似。

2．方法学评价 不同的血清学方法检测结核患者特异抗体，各有其缺点。

（1）PHA：PHA中最先用来研究结核病血清学试验之一，其结果直接依赖于所用红细胞的稳定性，早期研究由于红细胞稳定性不佳，且多种抗原都能结合在细胞上，因而结果不够理想。直到醛固定红细胞的广泛应用，特别是戊二醛和丙酮醛的应用，使得其结果令人满意。且是一种敏感的抗体半定量检测方法，在所有被检标本中都能测出抗体，当以滴度≥1∶64为阳性时，结核患者阳性率明显高于正常健康人（包括与患者密切接触的家庭成员）。且以抗体阳性滴度表示，有利于结核患者化疗后的动态观察。不仅如此，该法还具有试剂保存时间长，4～20℃均可长期保存致敏的红细胞，克服了ELISA中酶试剂保存期短的不足。

（2）反向间接血凝抑制试验：PHA检测结核患者特异性抗体，需尽可能地纯化抗原，否则致敏时可产生自凝现象。而反向间接血凝抑制试验不需使用特别纯化的抗原，且阳性率高于PHA。但也有其不足，①患者血清需空腹抽血，否则产生干扰；②单克隆抗体很容易失活，不稳定；③若单克隆抗体不纯，亦可使致敏红细胞发生自凝现象。

（3）ELISA：ELISA是广泛用于结核病血清学检查的四大免疫标记技术之一，它具有敏感性高和特异性好的优点，结果用肉眼观察或用酶标比色计均可测定，且需标本少适用于多标本测定，特别是适用于流行病学普查。对于不同类型的结核病其阳性率不一致，结核患者阳性率明显高于健康人和其他疾病，肺结核阳性率高于肺外结核，结核性胸（腹）膜炎患者胸腔积液（或腹水）和结核性脑膜炎患者CSF的阳性率高于自身血清，痰菌阳性的患者血清高于痰菌阴性患者。

ABC－ELISA是ELISA基础上建立的一种方法，比ELISA更敏感，见表4－1。

ELISA抑制试验不需特别纯化分枝杆菌抗原，而是需单克隆抗体，比ELISA多一个试验步骤。由于单克隆抗体纯化较MTB抗原纯化容易，因而其特性很高。

（4）SPRIA：SPRIA也是近10年来用于检测结核病特异抗体的三大免疫标记技术之一，同样具有敏感性和特异性很高的优点。与ELISA一样，需纯化MTB抗原，且放射性核素半衰期仅60d左右，试剂不易保存，加之需γ－计数仪，放射性核素对试验人员有害，故不如ELISA方便，以致我国多使用ELISA检测结核患者特异性抗体。

二、特异性抗原测定

结核患者痰、胸腔积液（或腹水）、尿液和CSF等中均可检测出MTB抗原。现用于其抗原检测的方法有ELISA，ABC－ELISA和胶乳颗粒凝集试验（latex particle agglutination，LPA）等。

（一）双抗体夹心ELISA法（double antibody sandwich ELISA）

1．原理 用MTB鼠源性单克隆抗体包被固相载体，当加待检标本时，则标本中的抗原与载体上的单克隆抗体特异性的结合，形成固相化的抗原抗体复合物。洗去未结合部分，再加入兔抗分枝杆菌IgG（或兔抗BCG IgG）与上述复合物结合后，再洗去未结合部分，加酶标羊抗兔抗体，最后加入酶底物时，由于酶的催化作用而显色，根据颜色的深浅，即可判断标本中是否有MTB抗原。

2．试剂

（1）鼠源性H37Rv单克隆抗体。

（2）抗MTB（H37Rv）免疫血清制备：取健康成年雄性家兔3只，体重约2．5kg。首次兔免疫用H37Rv株制备的聚合OT，加等量不完全弗氏佐剂，注射家兔脊柱两侧皮下各5点，双中掌皮下各0．1ml。10d后用聚合OT皮下免疫3次，每次间隔1周。然后改后静脉免疫，1周1次，共4次，末次免疫2周后放血，当抗体效价达1∶5 000时（ELISA法），心脏取血后，分离血清，再经50%饱和硫酸铵沉淀1次，33%的半饱和硫酸铵沉淀2次，以流水透析去盐，然后过DEAE纤维素柱纯化。测蛋白质含量后分装冻存备用。

（3）包被液、洗涤液、稀释液、底物缓冲液和底物溶液参考一般方法。

（4）0．5%胰蛋白酶溶液。

3．方法

（1）痰液的消化取0．5ml痰液与等量0．5%的胰蛋白酶过夜混合，37℃2h使其液化。其他标本离心后直接用。

（2）单抗包被MTh鼠源性单抗经包被液做1∶80（经方阵滴定确定最佳稀释度）稀释，于聚苯乙烯酶标板中，每孔加入0．1ml，置4℃过夜或37℃2h，以洗液3×3min洗涤。

（3）加待检标本每孔加入待检标本0．1ml，每份标本加2孔。置37℃2h后倒空标本，如上洗涤。

（4）每孔加工作浓度兔抗结核IgG 0．1ml（经方阵滴定确定兔抗结核IgG最佳工作浓度为20μg／ml），37℃1h后，如上洗涤。

（5）每孔加入工作浓度的酶标羊兔IgG 0．1ml，37℃40min后，如上洗涤。

（6）每孔加入新鲜配制的底物0．1ml，37℃20min，以1mol／L H2SO450μl终止反应。用492nm测各孔吸光度A值。

4．结果判断 试验时设有已知阳性（一定浓度的PPD）、阴性（健康人痰液，该法测不出MTB抗原）、已知阳性加等量0．5%胰酶（与标本处理一样），0．5%胰酶和空白5种对照。当阳性对照、阳性＋胰酶对照均阳性，胰酶、阴性对照显色结果才判为有效。P／N值≥2．1为阳性。

5．参考值 健康人为阴性。

6．方法学评价 刘君炎等测定了100例结核患者和100例非结核患者痰，阳性率为73%，假阳性率为3%，该试验的敏感性为0．5μg，虽与MOTT有交叉，但该试验重复性好。

（二）ABC－ELISA法

1．原理 将待检测抗原包被于酶标反应板上，经封闭后，加入鼠抗MTB备用血清，若待检标本中含MTB抗原时，抗原抗体即发生结合。洗去多余的抗血清，加入生物素化羊抗鼠IgG抗体，进行孵育，使之与抗原抗体复合物结合，再加入酶标记的亲和素，使之与上述复合物结合。经加入底物呈色后，492nm测各孔的吸光度A值。

2．试剂

（1）鼠抗MTB血清的制备取培养7周的H37Rv菌株用无菌生理盐水配成2mg／ml菌液。60℃30min灭活后与等量不完全弗氏佐剂混合，注入小鼠腹腔内，每只0．2ml。2周后再同样注射1次，隔2周再用2mg／ml菌液加强注射2次，每只0．2ml，中间隔1周，末次注射后1周腋下动脉放血，得鼠抗H37Rv多克隆抗体的IgG抗血清。经琼脂扩散，滴度达1∶32时，保存备用。

（2）生物素化羊抗鼠IgG抗体、酶标亲和素。

（3）其他试剂同ELISA法。

3．方法

（1）标本的处理痰液经超声处理1min，使之液化。加入2倍量0．4mol／L pH3．5醋酸缓冲液，加热至80℃保温30min，待冷后每分钟3 000转离心10min。取上清液备用。

（2）抗原包被处理后的标本以1∶3与pH7．4PBS混合后，加入聚苯乙烯酶标反应板中，每孔0．1ml，每份标本2孔，4℃过夜，次日以洗涤液3×3min洗涤。

（3）封闭：每孔加封闭液（含10%兔血清，0．5%吐温－20、0．02mol／L pH7．2的PBS）0．1ml，37℃1h后，同上洗涤。

（4）用稀释液将鼠抗MTB血清1∶800稀释（稀释度经方阵滴定确定），每孔0．1ml，37℃1h后，同上洗涤。

（5）加生物素化羊抗鼠IgG抗体（稀释度经方阵滴定确定）0．1ml，37℃1h，同上洗涤。

（6）加最适量工作浓度的酶标亲和素0．1ml于各孔内，37℃15min后，同上洗涤。

（7）加底物溶液0．1ml于各孔内，37℃15min显色后，各加入1mol／L H2SO450μl终止反应。再经492nm测其吸光度A值。

每次试验均以处理过的菌液上清为阳性对照，同时设立试剂空白，经底物对照调零。

4．结果判断 临界值＝阴性对照A值＋3SD；阴性，样品A值＜临界值；阳性，样品A值≥临界值。

5．参考值 正常健康人为阴性。

6．方法学评价

（1）该法的灵敏度为87．4%，痰液中MTB菌1 000条／ml即可测出阳性，特异性为95．01%。

（2）与MOTT亦有交叉。

（三）LPA法

1．原理 以胶乳作载体，胶乳颗粒吸附兔抗MTB胞质膜抗原的制备血清，致敏胶乳与MTB抗原可发生凝集反应。

2．试剂

（1）MTB胞质膜抗原。

（2）抗体致敏胶乳试剂的制备：用0．2mo1／L pH7．4甘氨酸缓冲液（GBS）将纯化的兔抗MTB胞质膜血清做1∶2稀释，与10%的胶乳悬液等量混合，置37℃水浴2h，中途轻轻振摇数次，以每分钟4 000转离心20min，去上清液。沉积物用含100g／L，小牛血清蛋白的GBS洗2次，再用GBS配制成25g／L悬液。此即致敏胶乳试剂，4℃保存备用。

（3）对照胶乳试剂的制备用纯化正常兔抗血清致敏胶乳颗粒。

3．方法 将待检标本56℃水浴1h，除去非特异性干扰。取背景为黑色的玻片，每份标本分别加入2个圆圈内，各20μl，再于1个圆圈内加20μl对照胶乳试剂，另1个圈内加抗体致敏胶乳试剂，混匀后3min观察有无凝集，出现凝集（对照圈内无凝集）为阳性，2个圈内均无凝集者为阴性。

4．参考值 正常健康人CSF为阴性。

5．方法学评价 该法十分简单、快速，是结核性脑膜炎早期诊断的敏感性方法之一。Krambovitis等检查了18例结核性脑膜炎患者CSF，阳性率为100%，同时检测了134例化脓性脑膜炎及其他传染病患者SCF，仅1例嗜血流感杆菌b型脑膜炎患者为阳性，特异性达99．3%。此外，该法还可用于其他体液中MTB抗原的检测。

三、免疫球蛋白测定

（一）概述

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是一类在抗原的刺激下所产生的具有与该抗原发生特异性反应的球蛋白。大多数具有抗体活性，普遍存在于血液、淋巴液、CSF和胸腔积液（或腹水）等中。目前已发现人体内有5种Ig，即IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。在正常人体Ig含量相对稳定，在疾病时可发生一定的变化。各种Ig的理化性质和生物学特性见表4－2。

表4－2 Ig的理化性质和生物学特性

（续 表）

（二）检测方法学

Ig测定方法较多，现就常用的方法做一介绍。

1．散射比浊法

（1）原理：待测免疫球蛋白和相应二抗结合后，经一定时间（30～60min）形成复合物，用特定散射比浊仪，测定复合物散射光值。散射光强度与复合物的量成正比，即与抗原含量成正比。

（2）试剂与材料

①免疫比浊仪。

②配套的试剂盒（内含稀释液、缓冲液、抗血清、定标液等）。

（3）方法

①用专用比浊管加入缓冲液0．6ml，适当稀释（1∶36～1∶216）样品50μl，再加入抗血清5%μl，每标本均设置空白管（不加抗血清）。同时设置标准管及标准空白管。混匀后置室温或37℃30min。

②使用激光免疫比浊仪，开启电源复零后，按预测项目（如IgG）键或刷试剂盒配套程序卡，调出测定程序。

③以标准空白管测本底，检测标准管。同样以标本空白管测本底，检测标本管。立即显示所测项目含量。

（4）参考值：成年人IgG，7．0～16．0g／L；IgA，0．7～4．0g／L；IgM，0．4～2．3g／L。

2．透射比浊法

（1）原理：当抗原与抗体在稀释系统中反应而又比例合适（抗体必须过量）时，形成的免疫复合物（IC）在PEG等作用下，在液相中形成微粒。当抗体浓度固定时，IC的量与检样中抗原的量成正比。IC的量可用测定吸光度的方法得出。当抗原浓度在一定范围内时，IC（或抗原）的量与吸光度成正比。

（2）试剂与材料

①抗血清各种抗Ig血清质量要求严格，除要求高效价、高纯度、高亲和力外，必须不含任何干扰粒子，应高速离心去除血脂，并经超滤膜过滤，达到“比浊级”。

②参考品：采用国际参考品或经其准确标化的参考品。

③缓冲液各仪器常有指定缓冲液，下列配方可供参考，见表4－3。

加蒸馏水至1 000ml，用3号玻璃滤器过滤，室温保存。

（3）方法

①抗血清浓度选择与参考品进行方阵滴定，最适稀释度选择原则为，保持抗体过量，线性范围较宽，与相应Ig反应后产生浊度较高，节约抗血清。

②标准曲线将Ig参考品用稀释液稀释成不同浓度。

表4－3 透射比浊法缓冲液配方

IgG：5．0g／L、9．0g／L、13．0g／L、17．0g／L、21．0g／L

IgA：1．0g／L、2．0g／L、3．0g／L、4．0g／L、5．0g／L。

IgM：0．5g／L、1．2g／L、1．9g／L、2．6g／L、3．3g／L。

各稀释度各设3支复管，每管25μl。加入最适稀释度抗血清，每管2．5ml。37℃水浴1h（IgG）或2h（IgA、IgM）后，用浊度计或比色计测定495nm吸光度。以Ig浓度为横坐标，各浓度吸光度为纵坐标制备标准曲线。

③标本检测检测步骤与制备标准曲线相同。测IgG时，待检血清1∶40稀释；测IgA、IgM时1∶5稀释。每批试验同时制备标准曲线，并设标本对照（标本加稀释液）和抗血清对照。

④结果判断标本吸光度为测定管吸光度减标本对照与抗血清对照吸光度之和。查标准曲线可得各相应Ig含量。

（4）参考值：同散射比浊法。

3．琼脂扩散法

（1）原理：将被检标本做一定稀释，加入抗Ig的抗体琼脂板的孔内，在一定条件下，让其自由扩散，当抗原抗体的比例适当，则在孔周围出现白色沉淀环。沉淀环的直径与蛋白质抗原浓度的对数呈直线关系，以标准IgG、IgM和IgA的沉淀环直径与其含量在半对数纸上绘制标准曲线，所得待检标本的直径查标准曲线后，乘以稀释倍数，即得Ig的含量。

（2）试剂与材料

①0．12mol／L pH8．6巴比妥钠缓冲液。

②1．0%、0．12mol／L pH8．6巴比妥钠琼脂。

③抗人IgG、IgA、IgM血清和参考标准血清（即工作标准）。各生物制品所均有供应。

④5ml／L过氧乙酸。

⑤玻璃板8cm×14．5cm、厚3mm的玻璃板或用过的Ig测定彩色扩散板。

（3）方法

①琼脂板的制备：将加热隔水溶化的10g／L琼脂糖分装3支试管，每管4．7ml，然后移入56℃水浴中，待温度平衡后，分别加入上述抗人IgG、IgA、IgM血清（如其抗血清效价为1∶50，即每管分别加入0．3ml），使其最终浓度符合瓶签所标单向扩散效价，混匀后，分别倒入扩散板中，此时动作要迅速，防止琼脂糖凝固。待冷后，4℃保存备用。

②打孔：取孔径3mm打孔器在抗体琼脂板上相隔15mm（孔中心至孔中心）打一小孔，用针头挑去孔内琼脂，孔边要求圆而整齐，无缺损、无毛刺。

③参考血清（工作标准）的稀释。

第一，取14支试管编上2～15号。

第二，第2管加入生理盐水0．1ml，从第3管起到第15管各加生理盐水0．2ml。

第三，取冻干参考血清1支（标明0．5ml），先加蒸馏水0．5ml溶解，再加生理盐水0．25ml，混匀后即为1∶15倍稀释，即作第1管。

第四，从第1管取0．3ml加入第2管，再取0．2ml加入第3管。

第五，用0．2ml的吸管从第2管内吸出0．2ml加入第4管，混匀后再吸出0．2ml加入第6管……以此类推，跳管稀释至第14管。另用0．2ml吸管从第3管内吸取0．2ml加入第5管，混匀后，同上跳管稀释至第15管。

如此稀释后，各管参考血清倍数从第1管到第15管稀释倍数分别为1．5、2、3、4、6、8、12、16、24、32、48、64、96、128和192。

从第1、3、5、7、9管取样做IgM标准曲线。

从第4、6、8、10、12管取样做IgA标准曲线。

从第7、9、11、13、15管取样做IgG标准曲线。

参考血清设5个浓度值的合理依据应当是使正常人的Ig含量处于这几个浓度的中点前后，最边上的两个浓度可用来衡量被检标本超越正常范围的高或低值。有的参考血清是以U／ml表示，它与g／L（mg／L）的换算关系如下。

IgG 1U／ml＝0．08g／L

IgA 1U／ml＝0．014 2g／L

IgM 1U／ml＝0．008 47g／L

IgD 1U／ml＝1．41mg／L

第六，如以上海8310参考血清为例，经如上稀释3种Ig各5管的含量，适用于被检标本稀释倍数，如表4－4。

表4－4 参考血清稀释倍数及适用的被检标本稀释倍数

④待检标本的稀释取3支试管分别标明IgG、IgA和IgM，然后依次加入生理盐水0．46ml、0．45ml和0．4ml。用微量注射器取待检标本10μl加于IgG试管内，取50μl加于IgA试管内，取100μl加于IgM试管内，混匀。待检标本IgG、IgA、IgM的稀释度分别为1∶50、1∶10和1∶5。

⑤加样参考血清每个稀释度加3孔，待检标本每份加2孔，每孔10μl。

⑥将上述加好样的琼脂板先放在水平的桌面上30min左右，再移至有盖的湿盒内，置37℃水浴箱（37℃湿温亦可），IgG和IgA放24h，IgM放48h，观察结果。如果沉淀不明显，可置生理盐水中浸泡1h，中途换2次生理盐水，再用5ml／L过氧乙酸浸泡10min。

⑦读取结果用放大镜准确地（精确至0．1mm）测量沉淀环的直径，分别算出参考血清各浓度和被检血清的平均直径。

⑧绘制标准曲线在半对数纸上以参考血清Ig含量为横坐标，参考血清各浓度平均沉淀环直径为纵坐标绘制曲线。若几个点不在一条直线上，可相差甚远，应查找原因后重新测定。若几个点基本在一条线上，可经统计回归后画成一条标准曲线。

⑨待检血清的沉淀环平均值在标准曲线中查出其浓度，再乘以稀释倍数，即换算成IgM、IgA和IgG结果，以g／L报告之。

（4）参考值：同散射比浊法。

（5）注意事项

①该试验所用试剂如巴比妥缓冲液、浓度、pH，琼脂糖质量等均对结果有一定的影响，要求统一固定。每次新制备的琼脂糖板应重做标准曲线，并应用质控标本与以前的琼脂糖板对照。

②每次试验制板时，琼脂糖与抗血清的比例合适的温度以及孵育的温度与时间，要严格控制与标准曲线制作条件相一致。如用生物制品所出售的现成模板，浇板时必须在水平台上进行，以防出现琼脂糖板厚薄不均匀，而影响结果。

③稀释抗血清、测定标本及加样均要用微量注射器。加样要准确，每份样品加2孔，这样，可减少试验误差。

④模板的大小可根据各实验室的具体情况而定，无论板多大，其厚度以2～3mm为佳，并应恒定。试验时要谨防琼脂糖板与模板剥离，以避免标本从孔底外溢，造成结果不准。加样时，严禁样品或标准液溢出孔外，同时应防止微量注射器针头碰破琼脂糖边缘而造成沉淀环变形。

⑤试验过程中要始终保持水平位置，特别是放置在37℃水温箱内孵育时更应保持水平，否则，沉淀环将变成椭圆形，影响读数。

⑥测定沉淀直径应准确，最好用解剖显微镜中的测微器，误差＜0．1mm。若用放大镜其放大倍数以4～6倍为宜．倍数太小影响准确，倍数太大可因边缘模糊造成误差。若出现椭圆形沉淀环，要同时测其横径与直径，求其平均值作为沉淀环的直径。

⑦Ig琼脂糖板保存时间不能太长，防止琼脂糖板中水分蒸发及变形而引起误差。密封保存的琼脂板应加NaN3至0．1g／L防腐。即使4℃保存也不宜超过3个月。

⑧标准曲线的绘制是整个实验准确与否的关键问题之一。每批抗血清在正式使用之前，需预先摸索最适抗血清稀释倍数。并用已知标准参考血清绘制出满意的标准曲线，此曲线应斜率好、截距小、计算绘图容易，线性关系好。

（6）临床意义：不同年龄组健康人血清中3种Ig含量参考值见表4－5。

①健康人血清IgA、IgG和IgM与非活动性肺结核患者相比，均无统计学差别；而与活动性肺结核相比，则后者血清IgA和IgG明显升高，IgM无差别，IgG中以IgG2亚类最为明显。随有效的治疗，IgA和IgG含量逐渐恢复正常。因此，测定血清中IgA和IgG含量，可作为判断肺结核活动与否的参考指标之一。

②王相辅等报道CSF中IgG、IgA和IgM含量分别为（36．8±2．14）mg／L、（15．5±1．27）mg／L和0。结核性脑膜炎时，CSF中IgG、IgA和IgM含量显著升高，尤以IgG升高为主。化脓性脑膜炎患者CSF中IgG和IgM含量明显升高，真菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎患者CSF中IgA、IgG和IgM含量变化不大。结核性脑膜炎患者在抗结核治疗中，CSF中IgG含量变化敏感，且在临床症状改变之前即发生改变，重症患者尤为明显。

表4－5 不同年龄级健康人血清3种Ig水平参考值

（三）方法学评价

琼脂扩散法是经典的检测方法，特异性强是其优点，但反应时间过长、灵敏度不高、线性范围窄、结果不易判读及无法自动化批量检测是其致命弱点。免疫透射法较之琼脂扩散法最大的特点是大大缩短了反应时间、扩大了检测范围及易于自动化检测；其不足之处在于，以适用于均相液体的朗伯－比尔定律原理进行透光性检测。由于反应产物抗原抗体复合物多以颗粒性非均相液体形式存在，且在比色过程中逐渐发生沉降，以分光光度计比色，其吸光度波动较大，结果重复性差。而散射比浊法则克服了上述弱点，结果重现性好（变异系数，1．9%～3．5%），是理想的检测方法。

四、循环免疫复合物测定

抗原抗体复合物简称免疫复合物（immune complex，IC）。近年来已引起实验室工作者和临床医师的广泛关注。根据形成免疫复合物的抗原抗体是已知的，还是未知的，可分为两大类，前者称特异性免疫复合物，后者称非特异性免疫复合物。

（一）非特异性免疫复合物

非特异性免疫复合物检测方法较多，目前，WHO推荐clq固相和液相结合试验、胶固素结合试验、单株类风湿因子试验和Rrdji细胞放射免疫试验作为临床实验室常规检验法。现结合国情介绍于下。

1．丽春红－S比浊法

（1）原理：丽春红－S（P－S）是带磺酸基的酸性染料，在三氯乙酸（TCA）溶液中蛋白质带正电荷，而带负电荷磺酸基与TCA根离子结合形成一有色复合物沉淀下来，CIC是蛋白抗原抗体结合而成，当染料TCA浓度一定时，形成复合物的多少与CIC含量成正比。

（2）试剂

①0．1mol／L硼酸盐缓冲液：0．1mol硼酸、25mmol硼砂、75mmol NaCl，加水100ml调pH至8．4。

②PEG沉淀剂：取PEG6000 62．5g、EDTA－Na 18．6g，加上述0．1mol／L，硼酸盐缓冲液至1 000ml。

③洗涤剂：取PEG6000 25g，加上述0．1mol／L硼酸盐缓冲液至1 000ml。

④P－S储存液：称取P－S 0．2g、氨基水杨酸（SSA）3．0g、TCA 3．0g，加蒸馏水溶解至1 000ml。

⑤P－S应用液4ml，用3%TCA液稀释至100ml。

⑥0．2mol／L NaOH溶液。

⑦热聚合人IgG的制备10mg／ml人IgG标准品经63℃加热20min，立即置冰浴中速冷，稀释10倍即成热聚合人IgG标准品（1 000μg／ml）。

（3）方法：取一支试管（15mm×100mm），加待检血清0．1ml，再加入0．1mol／L硼酸盐（pH8．4）缓冲液0．9ml，PEG沉淀剂1．0ml，充分混匀，置4℃冰箱2h。1 500g离心10min，去掉上清液，加1ml PEG洗涤剂离心洗涤2次，在滤纸上沥干为测定管。加1ml P－S应用液，放室温2min后1 500g离心8min。去上清液倒立于滤纸上，加0．2mol／L NaOH 2ml混匀。在570nm处，蒸馏水调零点，测定其吸光度。结果查标准曲线即得。

（4）标准曲线的制备：取热聚合人IgG（1 000μg／ml）按下表操作，其操作步骤与测定标本的方法相同，将所得结果在坐标线上绘制成曲线即为标准曲线，见表4－6。

表4－6 标准曲线制备（ml）

（5）参考值：38～72μg／ml。

2．聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种不带电荷的直链大分子多糖，为乙二醇的聚合物。分子式为（CH2CHO）n。不同浓度的PEG可沉淀分子量不同的蛋白质。如表4－7。

表4－7 沉淀常见蛋白质所需PEG浓度

（1）原理：PEG沉淀蛋白质具有可塑性，被沉淀的蛋白质其生物活性不受影响，在pH与离子强度固定时，蛋白质分子量越大，用于沉淀的PEG浓度则越小。特别是PEG6000，对蛋白质沉淀具有良好的选择性。由于PEG对IC的沉淀无特异性，为避免其他血清蛋白，特别是IgM同时沉淀，PEG6000的最终浓度不宜小于25g／L。

（2）试剂

①0．1mol／L pH 8．4硼酸盐（BB）缓冲液，用G3或G4玻璃滤器过滤。

②PEG－NaF稀释液：PEG6000 40．0g，NaF 10．0g，BB缓冲液加至1 000ml，溶解后用G3或G4玻璃滤器过滤。

（3）方法

①取待检亦清0．15ml，加BB 0．3ml（1∶3稀释）。

②按表4－8所示，加入各液（待检血清最终稀释倍数为1∶33，PEG最终浓度为36．4g／L）。

表4－8 聚乙二醇沉淀法测定步骤

（4）计算

（5）参考值：4．3±2．0（A），以＞8．3为免疫复合物阳性。

（6）注意事项

①PEG6000的浓度、离子强度及pH必须严格，以免实验结果不稳定。

②该方法简单易行，但有假阳性，高γ－球蛋白血症以及血清标本反复冻融，均易造成假阳性，有2%～3%的IgG、5%～6%IgM也可被沉淀。故该法仅适用于筛查。

③该法受作用温度与时间、离心速度与时间等影响，故应严格掌握，以求实验结果一致。

④该法灵敏度较其他方法稍低。

3．SPA夹心ELISA试验

（1）原理：金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）与免疫复合物中IgG的Fc段结合。将待测血清由浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上。再以酶标记的SPA与之反应，即可检测检样中有无CIC。

（2）试剂

①50．0g／L与25．0g／L（PEG6000）用0．02mol／L pH7．4PBS配制。

②牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0．05mol／L pH7．4PBS配制，含0．01mol／L EDTA、1．0g／L叠氮钠、0．05%吐温－20和4．0g／L BSA。

③HRP－SPA：SPA与辣根过氧化物酶（HRP）用改良过碘酸钠法制成结合物，最适工作浓度用方阵法滴定，也可购商品试剂，按说明书使用。

④热聚合人IgG（HAHG）同丽春红－S比浊法。

（3）方法

①用PBS稀释SPA成5μg／ml，包被聚苯乙烯反应板，每孔100μl（对照孔不包被），4℃过夜后常法洗涤3次，每次3min。下同。

②待测血清50μl，加PBS 150μl，50．0g／L PEG 200μl混匀，4℃过夜后，每分钟3 000转离心20min，弃去上清液。沉淀用25．0g／L PEG洗涤2次。加入PBS 200μl，BSA缓冲液200μl，混匀，3℃水浴30min，不时摇动，使全部溶解。

③将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃60min，洗涤3次。各孔加最适浓度HRP－SPA 100μl，37℃20min显色。加1mol／L H2SO450μl，终止反应，测波长492nm的吸光度。

④标准曲线制备：取正常人血清20μl，加HAHG（120μg／ml）200μl，再加PBS 0．4ml，50．0g／L PEG 0．8ml，4℃过夜。同时做不加HAHG正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀、清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量0．01mol／L pH7．4PBS）1．6ml溶解并分别稀释成120μg／ml、60μg／ml、30μg／ml、15μg／ml和7．5μg／ml，与待测血清同法操作，制成标准曲线。

（4）结果判断：以待测血清吸光度值查标准曲线，即可求得相当于HAHG的CIC含量（μg／ml）。

（5）参考值：以＞28．4μg／ml为阳性。

（6）注意事项

①HAHG应分装储存于－20℃，不宜反复冻融，否则易解聚。加入BSA至最终浓度5．0g／L，可使HAHG稳定。

②PGE浓度影响CIC沉淀的量，须严格控制。

4．牛胶固素－ELISA法

（1）原理：牛胶固素是牛血清中含有的一种蛋白质，其性质稳定、耐热。无种属特异性，能与IC上结合的C3a牢固地结合。用牛胶固素包被固相载体，加待检血清，如果待检血清中有IC存在，IC上的补体就与牛胶素牢固地结合，再加入抗人IgG酶标抗体，即可形成牛胶固素－补体。抗原抗体抗人IgG酶标抗体复合物，最后加入酶底物溶液显色，观察颜色深浅，即可得知被检血清中IC的存在与含量。

（2）试剂

①牛胶固素生物制品所有售。

②pH9．6CFD液（complement fixation dituent）：巴比妥0．25g、巴比妥钠17．7g和NaCl 8．5g溶于500ml蒸馏水中；MgCl20．168g溶于100ml蒸馏水中；CaCl20．028g溶于100ml蒸馏水中。将上述3种溶液混合后，补足蒸馏水至1 000ml，调pH至9．6后，加NaN30．2g防腐，4℃保存，使用前加明胶至10g／L。

③pH7．2CFD液：除改巴比妥钠为0．185g、巴比妥为0．575g外，其余同pH9．6CFD液。

④底物缓冲液参考一般方法。

⑤热聚合IgG取纯化IgG 1．0g，溶于100ml生理盐水中，置室温2～3h后，63℃水浴12min，再徐徐加入6．7g Na2SO4（每次1g），置4℃1h，取出后每分钟2 000转离心20min，弃上清液，沉淀物溶解在100ml（0．1mol／L，pH7．2）PBS中，用PBS透析24h，测其蛋白质含量，最后用0．1mol／L pH7．3PBS稀释至蛋白A含量为12～15g／L，－20℃保存备用。用时以0．05mol／LpH7．2PBS－Tween－20配制成lmg／L、10mg／L和100mg／L 3种不同浓度。

（3）方法

①将牛胶固素以pH9．6CFD配成0．5mg／L包被于聚苯乙烯酶标板上，每孔0．1ml，过夜后用pH7．2CFD洗涤3×3min。

②每孔用pH7．2CFD稀释成1∶20的被检血清0．1ml，同时加不同浓度的热聚合IgG和阴性血清各2孔，每孔0．1ml，37℃2h后同上洗涤。

③各孔加抗人IgGHRP 0．1ml，37℃2h后同上洗涤。

④各孔加新鲜配制底物溶液0．1ml，37℃15min避光显色后，用1mol／L H2SO450μl终止反应。

⑤492nm测其吸光度值。

（4）结果判断：以热聚合IgG含量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，从标准曲线中可查出待检标本的IC含量，再乘以稀释倍数。

（5）参考值：血清1～36mg／L，若＞36mg／L为阳性。

5．非特异性IC在结核病中的应用 60%～80%的活动性结核病患者血清IC含量升高，其阳性率高低顺序为：浸润性肺结核＞结核性胸（腹）膜炎＞其他肺外结核。经3～6个月的抗结核治疗后，若IC降至正常，说明抗结核治疗有效；若经3～6个月抗结核治疗后，IC不下降或持续升高，则预后不佳，病变可能向难治方向转化。

（二）特异性免疫复合物

1．ELISA法

（1）原理：将提纯的PPD经包被液稀释至一定浓度后，包被于聚苯乙烯酶标反应板上，加入PEG提取的IC，经一定时间孵育，形成抗原抗体复合物，经洗涤除去多余的复合物，然后加入兔抗人IgG酶标记物，与上述复合物结合，再加入底物显色后，用1mol／L H2SO4终止反应，以492nm测其吸光度（A）值。即可测出标本IC中抗体的含量。

（2）试剂

①41．66g／L PEG6000：41．66g PEG6000溶于1mol／L pH8．4BB缓冲液1 000ml中。

②37．5g／L PEG6000：37．5g溶于1mol／L pH8．4BB缓冲液1 000ml中。

③保温液：pH7．4PBS吐温－20洗涤液100ml，加牛血清白蛋白100mg。

④洗涤液、包被液、稀释液和底物缓冲液参考一般方法。

（3）方法

①血清的处理：取血清0．3ml于离心管中，加BB缓冲液0．58ml，再加41．66g／L PEG6000 8ml，混匀后置室温1h，以每分钟3 000转离心15min，弃上清液，再用37．5g／L PEG6000洗2次。将离心管倒立于滤纸上约5min。

②将沉淀物用0．6ml保温液溶解，以此代替1∶100的血清，按ELISA法测IC中抗PPD抗体。

（4）结果判断：（A测－A空白）÷（A阴性－A空白）≥2．1为阳性；＜2．1为阴性。

（5）注意事项

①更换不同品牌酶标反应板或试剂时，必须经用阳性、阴性标本对照试验后，方可使用。

②血液标本需立即分离血清后测定，或分离血清后－20℃保存，要求在1周内完成。

2．ABC－ELISA法

（1）原理：预先将羊抗人IgG和羊抗人IgA同时包被于聚苯乙烯酶标反应板的同一孔中，4℃过夜，经封闭后，加入经PEC沉淀的IC，经过一定时间结合后，加入生物素标记的兔抗MTB抗体，ABC复合物，最后加入底物显色后，终止反应，经492nm测其吸光度，即可求出特异性IC的含量。

（2）试剂

①抗MTB血清制备H37Rv。菌株于苏通培养基上培养8周。煮沸5min杀死后，离心取菌体，再超声粉碎（振幅15M15min）、4℃离心（每分钟4 000转）15min，取上清液即为免疫用抗原。将上述5mg／ml的抗原与等体积福氏不完全佐剂（incomplete Freund’s adjuvant）混合（首次免疫另外混入20%的H37Rv死菌体），按足垫→皮下→肌肉→静脉混合免疫兔，第6周采血，与5mg／ml的上述抗原进行琼脂扩散，效价1∶32。

②抗血清纯化及标记生物素将兔抗MTB血清先用半饱和硫酸铵和硫酸铵沉淀法提取球蛋白，再经DEAE纤维素提取IgG兔抗MTB免疫球蛋白，紫外分光光度计测其蛋白质含量为2．5mg／ml（此时与抗原双扩散仍能出现明显的沉淀线）。再取部分兔抗MTB免疫球蛋白按5∶1与生物素（酰N－羟基丁二酰亚胺脂）结合，即生物素标记的兔抗MTB抗体。

③标准MTB：特异性IC的制备取25例结核患者混合血清，分别加入MTB 500μg／ml、250μg／ml、125μg／ml和62．5μg／ml，混匀后于37℃水浴1h，置4℃过夜后同标本测定IC。

④羊抗IgG和羊抗人IgA（生物制品所有售）。

⑤其他试剂同ELISA法。

（3）方法：取血清0．3ml加0．15ml的0．3mol／L EDTA混匀，每分钟500转离心5min，取上清液0．4ml加0．4ml 7%PEG／PBS（pH7．4），4℃过夜，同上离心5min，取沉淀溶于0．2ml的pH7．4PBS（含10%的小牛血清）中，此为待测标本。

用羊抗人IgG（25μg／ml）包被同一块聚苯乙烯酶标反应板各一半孔（0．1ml／孔，下同），4℃18h以上，以10%小牛血清／PBS－Tween封闭，40℃1h。再加入待测标本（同份标本于同板时对羊抗人IgG、羊抗人IgA反应），40℃1h，随后依次加入生物素化兔抗MTB抗体（4μg／ml）40℃30min、ABC复合物40℃30min，底物溶液15min，1mol／L，H2SO4终止反应，最后以492nm比色测吸光度（A）。

（4）结果判断：以高于同板阴性对照血清A值×1．5为IgG型IC阳性；以高于同板阴性对照血清A值×1．3为IgA型IC阳性。

3．特异性IC检测的方法学评价及临床意义

（1）ELISA和ABC－ELISA法测定方法简单，特异性、敏感性和稳定性都较高。后者利用抗人IgG及抗人IgA捕捉住IgG型及IgA型IC，然后用生物素标记的探针对IC中MTB抗原的抗体进行检测，不仅方法简单，而且直接证实了结核患者血清中确含有完整的结核性IC。

（2）ELISA法和ABC－ELISA法检测结核患者IC阳性率均为85%左右，特异性为90%左右。由此可知，两者均可用于结核病的诊断及肺部疾病（肿瘤、炎症）的鉴别诊断。

（3）ABC－ELISA法检测结核患者IgA型IC阳性率为73%，IgG型阳性率为35%，正常健康人的非特异性反应前者为7．5%，后者为2．5%。

（4）ABC－ELISA和ELISA法不仅可用于结核病的诊断，对不典型的结核病或稳定期结核病表现为自身免疫疾病者的诊断也有一定价值，而且对结核病的病因学及体液免疫机制提供了一定的证据。