一、溶菌酶
溶菌酶（lysozyme，LZM）（细胞质酶，E．C．3．2．1．17）于1922年由Fleming自鸡卵中首次发现并分离，其分子量为14 500，能水解细菌细胞壁的N－乙酰胞壁酸－β－1，4N－乙酰葡萄糖胺（N－acetylmurammic－β－1，4－N－acetylucosamamine）中的糖苷键，从而使细菌热较稳定，在碱性溶液中，随温度升高很快失活。易溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。LZM由18种氨基酸组成。
LZM广泛分布于哺乳动物的组织、体液与分泌物中，其中以血液、肺、肾、唾液与泪液等含量为高，尤以泪液含量为最高，为血清浓度的100～150倍。通过对各种血液的有形成分测定，发现血清中的LZM主要来自于中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞的溶酶体，某些活动性肉芽肿疾病，包括结核病、结节病、克罗恩病等患者血清LZM含量升高。而淋巴细胞、血小板、红细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、巨核细胞、原始淋巴细胞和原始粒细胞均无LZM活性。且单核细胞与巨噬细胞的LZM位于其表面，而中性粒细胞的LZM位于胞质深层，只有细胞裂解时才能释放出来。
LZM的检测方法常用比浊法、琼脂平板法和比色法。此外，还有酶免疫法、放射免疫法等，后两者虽很方便，敏感性很高，但试剂制作要求高，目前国内尚无试剂供应，在此不做介绍。
（一）光电比浊法
1．原理 将溶壁微球菌（micrococcus lysodeikucs）等菌体配制成基质液，加入一定量的标本，37℃作用2min，因标本中含LZM溶解微球菌，其浊度降低，其降低程度与标准的LZM作对比，即可计算出LZM的含量。
2．试剂
（1）菌液的制备
①新鲜菌液：将标准菌株（溶壁微球菌或八叠球菌）接种在普通琼脂平板上，24h用0．067mol／L PBS洗下，配制成混悬菌液，56℃30min后，用分光光度计640nm测定吸光度A值为0．2左右。
②干菌粉：称取干菌粉50mg，放入0．067mol／L，PBS 50ml内，充分混匀，用分光度计640nm测定A值为0．2左右。
（2）LZM标准液：称取LZM 5mg（2 500U／mg）溶于0．067mol／L pH7．4PBS液5ml中，再稀释成100mg／L、50mg／L、30mg／L、20mg／L和10mg／L的不同浓度。
（3）0．067mol／L pH7．4PBS缓冲液。
（4）5mol／L KOH溶液。
3．方法 待测标本做适当稀释或不稀释（估计其LZM含量），取标本0．2ml于小试管中，37℃水浴5min，再向试管内加入37℃预温的菌液1．8ml混匀，立即计时，至2h，加入1滴5mol／L KOH溶液终止反应。立即将菌液倒入比色杯内，以640nm测其A1值。
另取同一标本0．2ml，先加1滴5mol／L KOH溶液，混匀，37℃预热5min，再加入1．8ml经37℃预热的菌液，在同样条件下测定A0值。
4．计算查曲线 A1－A0为标本吸光度，从已知的标准曲线上查标本中LZM含量。
5．标准曲线 将不同浓度的LZM标准液按标本一样进行测定，以吸光度为纵坐标，以LZM含量为横坐标绘制曲线。
6．参考值 血清LZM含量为5～10mg／L，尿液LZM含量为0～2mg／L，CSF中LZM含量为0～5mg／L
（二）琼脂平板法
1．原理 将溶壁微球菌液与琼脂混匀，浇注平板，待凝固后打孔，孔内注入待测标本，置室温（或37℃）扩散后，标本中LZM弥散如周围含菌的琼脂中，将微球菌溶解，出现透明的溶菌环。溶菌环的直径与LZM含量的对数呈直线关系，根据标准曲线即可算出样品中LZM含量。
2．试剂
（1）pH6．4 0．067mol／L PBS缓冲液。
（2）菌液制备：将微球菌接种于普通琼脂平板上，37℃培养24h。用蒸馏水洗下菌苔，每分钟2 500转离心15min，除去上清液。沉淀菌细胞用丙酮洗3次，乙醚洗2次后，置37℃烘干，研成细粉分装小瓶，密闭置4℃保存。用时以0．067mol／L pH6．4PBS配成100mg／ml浓度，以1层纱布过滤即成。
（3）含菌琼脂平板用0．067mol／L pH6．4PBS液配制。10g／L琼脂或琼脂糖（含硫柳汞0．1g／L），加热融化后冷至60℃时，加入上述菌液（最终含量为1mg／ml）充分混匀，浇注平板（平板可用免疫球蛋白测定用的彩色扩散板），浇注量按0．17ml／cm2计算，浇注时应保持平皿水平。凝固后，用金属打孔器打孔，孔径3mm。
（4）LZM标准液：称取LZM 2mg溶于2ml 0．067mol／L pH6．4PBS中，再用PBS稀释成5mg／L、10mg／L、20mg／L、40mg／L、80mg／L、100mg／L和200mg／L。
3．方法 取标本10μl加入含菌琼脂平板上的标本孔中，每块板上同时制备标准曲线，即将各浓度LZM标准液10μl分别加入2个复孔中，板置温盒内，37℃扩散24h后再观察结果。如果一次制含菌琼脂多块时，可只做一次标准曲线，但每块要以定值血清（20mg／ml）作质控。定值血清亦可用LZM标准液代替。
4．结果观察 测定标准曲线各浓度复孔溶菌环直径的均值，于半对数纸上以溶菌环直径为横坐标，LZM浓度为纵坐标，画出标准曲线。标本中LZM含量以所测菌圈直径自标准曲线换算。
5．参考值 同比浊法。
6．注意事项
（1）有关标本保存期限和LZM标准液的保存期，各文献报道各不一致。在缺乏肯定的实验数据之前，标本应新鲜，不超过12h。LZM标准液宜临用时配制。
（2）标本LZM含量过高，可稀释后再测定。实验时使用新菌液要谨防污染。
（3）为减少误差，每份标本应做复孔。
（三）比色法
1．原理 用活性染料艳红K－2BP将溶壁微球菌菌体染色，洗去游离染料。此染色菌体在标本中LZM作用下溶解，释放出染料，于520nm测其A值，即可根据标准曲线算出标本中LZM的含量。
2．试剂
（1）LZM标准液：将LZM 2mg溶于4ml蒸馏水中，用蒸馏水配成5mg／L、10mg／L、20mg／L、30mg／L、40mg／L和50mg／L（μg／ml）和0．5mg／L、1mg／L、2mg／L、3mg／L、4mg／L和5mg／L（μg／ml）两套标准液。
（2）0．6mol／L HCl水溶液。
（3）酸乳化剂：取非离子表面活性剂（俗称平平加）10g，加温溶于500ml蒸馏水中，取此液10ml，加0．6mol／L HCl 190ml即成。
（4）染色菌液：取干燥溶壁微球菌1．0g于研钵中研成细粉，再加入艳红K－2BP活性染料1．0g，继续研磨、混匀，再加入40ml 0．25mol／L NaOH拌成匀浆，22℃（室温）放置18～24h后，用蒸馏水反复洗涤，每次每分钟3 000转离心15min，弃上清液，至上清液无色为止。沉淀物中加入0．067mol／L pH6．4PBS缓冲液100ml，4℃保存。
3．方法 取标本0．5ml，加染色菌液1．0ml，充分摇匀，37℃水浴15min后，加酸乳化剂2．0ml。对照为染色菌液1．0ml，加酸乳化剂2．0ml，混匀后加标0．1ml。标准曲线为6支小试管，各加染色菌液1．0ml，再分别加入0．067mol／L。pH 6．4PBS液0．45ml、0．4ml、0．3ml、0．2ml、0．1ml和0．05ml。以上各管均于充分摇匀之后，每分钟3000转离心15min，取上清液比色。
4．结果观察 上清液于520nm测其A值。以标准LZM含量为横坐标，A值为纵坐标绘制标准曲线。标水中LZM含量可根据A值从标准曲线中查出。
5．参考值 血清3～10mg／L，尿液0mg／L，CSF中0～4mg／L。
（四）LZM测定的影响因素及方法学评价
1．影响因素 包括缓冲液的pH、测试温度、离子强度以及溶壁微球菌的制备方法。1．0g／L NaCl溶解细菌能力较大，当NaCl浓度高于1．0g／L时，溶解细菌能力下降。一些带阳电荷的分子或离子如钾、组蛋白等，可增加LZM活性；而一些带阴性电荷的分子或离子如肿素、透明质酸、DNA、RNA和某些氨基酸的共聚物等，可抑制LZM的活性。EDTA对LZM含量测定无影响。精胺、羟化四甲胺对溶壁微球菌细胞壁有保护作用，尽管对LZM活性无影响，但对LZM含量测定仍有干扰作用。
2．方法学评价
（1）比浊法是基于分光光度计测量其浊度变化。LZM溶解溶壁微球菌足一个复杂的过程，仅与酶的含量与活性直接相关。因此，比浊法测定的每批标本都必须作标准曲线，曲线的制作与标本测试条件务必一致，方能得出准确的结果。1980年Selsted等对比浊法进行了改进，将标本（或LZM标准液）与溶壁微球菌于37℃作用18h后，测其吸光度的变化，计算LZM的含量。由于LZM的稳定性高，其试验敏感度明显增加，LZM的最小检出量可达5ng／L，但比浊法菌液用量较大。若采用半自动或全自动生化分析仪，则可降低菌液的用量。
（2）琼脂平板法测定所需时间长，溶菌圈边缘不十分清楚，常难以准确测定，误差可达1mm以上，这样LZM含量的误差可达20%，尤其是含量在30mg／L以上时更为突出。
（3）比色法所需时间短，结果易观察，但活性染料不易获得。
（五）LZM含量测定在结核病诊断中的应用
1．结核病患者血清LZM含量依病情轻重而不同。轻度、中度和重症肺结核患者血清LZM含量分别约10%、50%和75%的升高。痰菌阳性患者明显高于阴性患者，约80%痰菌阳性患者血清LZM含量升高。
2．结核性胸腔积液（或腹水）和脓性胸腔积液（或腹水）（包括结核性脓胸和细菌性脓胸所致）中LZM含量明显高于癌性、结缔组织病、充血性心力衰竭和肝硬化等患者胸腔积液（或腹水）中LZM含量，而脓性胸腔积液（或腹水）又高于结核性腔积液（或腹水），约94%的结核胸性腔积液（或腹水）LZM含量超过30mg／L。而80%的癌性胸腔积液（或腹水）在30mg／L以下，充血性心力衰竭和肝硬化所致胸腔积液（或腹水）LZM含量均低于30mg／L。胸腔积液（或腹水）中LZM含量与蛋白质含量成正比相关，且随疾病的治疗及病情的好转而逐渐降低。
虽然结核性、癌性胸腔积液（或腹水）LZM含量有重叠，但测定胸腔积液（或腹水）LZM／血清LZM之比可减少重叠。结核性胸腔积液（或腹水）此比值均＞1，阳性率达90%～100%，阳性预计值和特异性均在90%以上，尤以脓性胸腔积液（或腹水）更为明显；而其他原因所致胸腔积液（或腹水），除偶见个别病例该比值＞1之外，其他均＜1。
3．正常CSF中LZM含量甚微，甚至不含LZM。化脓性脑膜炎和结核性脑膜炎CSF中LZM含量明显升高，而病毒性脑膜炎则正常。结核性脑膜炎随病情的恶化，LZM含量逐渐升高，随病情的好转则逐渐下降，痊愈者LZM含量为0。
4．BALF中LZM含量较低，都本业报道健康人BALF中LZM含量为（27±46．6）mg／L，肺结核患者BALF中LZM含量为（52±20）mg／L而支气管扩张合并感染者BALF中LZM含量为（256±136）mg／L，肺部肿瘤，鳞癌、腺癌和小细胞癌患者BALF中LZM含量分别为（362±348）mg／L、（246±235）mg／L和（181±85）mg／L。由此可见，BALF中LZM含量测定在肺癌和结核病的诊断上有一定价值。
5．由于化脓性脑膜炎与结核性脑膜炎CSF中LZM含量有重叠，因此，杨明清等根据结核性脑膜炎CSF中LZM主要来自于单核巨噬细胞，而化脓性脑炎CSF中LZM主要来自于中性粒细胞，从而设计了一个LZM指数公式，以表示LZM含量与中性粒细胞的关系。
结果18例结核性脑膜炎CSF中LZM指数为559．85，而26例化脓性脑膜炎CSF中LZM指数为3．31。由此可见，CSF指数是结核性脑膜炎与化脓性恼膜炎鉴别诊断的一个良好指标。
二、纤维连结蛋白
纤维连结蛋白（fibronectin，Fn）是人体含纤维蛋白原的血浆中分离出的一种大分子糖蛋白，有许多名称，如冷不溶性球蛋白（cold insoluble globulin，CIG）、细胞黏附因子（cell attachment factor，CAF）和细胞扩散因子（cell spreading factor，CSF）等。但现在公认为Fn，即纤维连结蛋白（纤维连结素、纤维黏附着蛋白）。
Fn的来源除成纤维细胞外，还有星形胶质细胞、内皮细胞、巨噬细胞、软骨细胞、Ⅱ型上皮细胞等。广泛分布于肺上皮细胞和内皮基底膜、细支气管及平滑肌，亦存在于正常人下呼吸道上皮表面液层和其他组织、器官中。Fn常分为血浆型（plasma fibronectin，PFn）和细胞型（cell fmronecfin，CFn），前者存在于血浆（清）和其他体液如羊水、胸腔积液（或腹水）、CSF等中；后者主要存在于结缔组织基质和细胞膜表面。PFn与CFn的分子结构基本上相同，只是PFt、分子量稍小，为（4～4．4）×105，溶解度稍大，氨基酸的排列顺序稍有不同。另外，PFn为二聚体，而CFn为多聚体，每个单位均有5条糖侧链，其糖侧链也有差别。
PFn在缩主防御系统中，作为一种非免疫调理蛋白起着重要作用。其表面排列着结合循环靶颗粒的位点（组织碎片，纤维蛋白聚体、血小板、免疫复合物和微生物等），一旦包被靶颗粒，则黏附于单核吞噬细胞系统中的吞噬细胞，通过吞噬细胞（巨噬细胞、尘细胞等）清除调理性颗粒。
此外，PFn还可与肝素、半乳糖苷、肌动蛋白、透明质酸、C1q和聚集的血小板相互作用。
检测Fn的方法常用胶乳凝集试验、单向免疫扩散、火箭免疫电泳和酶联免疫吸附试验等。
（一）胶乳凝集试验
1．原理 将明胶包被于胶乳颗粒上，加入标本时，标本中的Fn即可导致胶乳颗粒凝集。
2．试剂
（1）碳化二亚胺（ECDT）。
（2）明胶－胶乳：将ECDT 80mg溶于4ml 0．15mol／L pH7．3的PBS，加入0．4ml 10（W）羧化聚乙烯胶乳颗粒混匀，将80mg明胶溶于2．4ml上述PBS中，再将明胶液与胶乳颗粒混合，于25℃搅拌1h。以每分钟4 000转离心1h。弃去上清液，沉淀的胶乳颗粒用PBS洗1次，最后用PBS配成悬液，4℃保存备用。
3．方法
（1）待测标本用上述PBS做双倍连续稀释后，分别加至相应的试管中，每管150μl。
（2）按每2ml明胶一胶乳悬液加10μl（62．5U）肝素，混匀。
（3）各稀释度血清中加入已知有肝素的胶乳悬液，每管100μl，37℃振荡1h后观察结果。
4．结果判断
4＋ 凝集成块状，上清液清晰。
3＋ 凝集块状，但较疏松。
2＋ 凝集成颗粒状，上清液略浑。
1＋ 凝集成细颗粒状。
－ 无凝集。
参考值：以2＋凝集为阳性。根据待测定血清稀释度与标准参考品相比，可大致估算出标本中Fn的含量。
（二）单向免疫扩散法
1．原理 在含有特异性Fn抗体的琼脂凝胶板上打孔，当孔内加入待测标本并经37℃扩散24h，在加样孔周围可形成折射沉淀环，其直径与被测标本中Fn的含量成正比。
2．试剂
（1）Fn标准品：可从上海生物制品研究所购买，也可自制。自制方法是根据Fn能与明胶结合，将人血浆流脱明胶－Sepharose 4B柱，使Fn结合于柱上，再用尿素解吸。流程如下。
解吸物为粗提Fn可用于免疫制备单克隆抗体。为进一步纯化，可再流脱无Fn人血浆抗血清V－Sepharose 4B柱或抗人IgG Sepharose 4B柱，吸除杂蛋白，浓缩后测定蛋白质含量。
（2）抗Fn血清可从上海生物制品研究所购买，也可自制。Fn（2mg／ml）2ml加等量体积福氏不完全佐剂，充分乳化后，给家兔皮下多点注射，20d后注射第2次，再过20d后，每周注射不加佐剂的Fn 2～3次，每只兔注射总量20mg左右。如果所获抗Fn不纯，可流脱无Fn人血浆－Sepharose 4B柱（5～10ml），吸附杂抗体。
（3）1．17mol／L HCl：取浓盐酸193ml，加蒸馏水180．7ml。
（4）0．05mol／L pH8．2巴比妥钠－盐酸缓冲液。
（5）20．0g／L琼脂（琼脂糖）：琼脂糖20．0g，硫柳汞0．1g溶于1 000ml 0．05mol／L pH8．2巴比妥钠－盐酸缓冲液中，加热熔化，趁热分装于试管中，每管10ml加塞后4℃保存备用。
3．方法 取琼脂糖凝胶管1支，沸水溶化，置56℃水浴中，待温度平衡后，按抗Fn血清效价加入适量抗血清，混匀，浇制8cm×6cm免疫球蛋白胶板上，板厚16～17mm。待凝固后打孔，孔径3mm，将经等渗盐水稀释成300mg／L、250mg／L、200mg／L、150mg／L、100mg／L和50mg／L（根据标准品而定）的Fn参考标准品及待测标本各10μl于各孔内，37℃湿盒扩散24h，测沉淀环直径。以Fn含量为纵坐标，沉淀环直径为横坐标，于半对数纸上作图，绘制标准曲线。
4．参考值 待测标本中的Fn含量，可根据其沉淀环直径自标准曲线上查出。
（三）EILISA法
1．原理 根据Fn能与明胶结合的特性，将其最适浓度的明胶（或鼠抗人Fn－McAb）包被于固相载体表面，加被检标本与之反应后，再依次加入酶标抗体和酶底物，使之呈色。呈色程度与标本中Fn含量成正比。
2．试剂
（1）Fn标准参考品：同单向免疫扩散法。
（2）鼠抗人Fn单克隆抗体（McAb）：将提纯的Fn免疫BALB／c小鼠，用细胞融合技术建立分泌抗人Fn－McAb杂交菌株。
（3）HRP－鼠抗人Fn－McAb用改良过碘酸钠法制备（详细过程见有关酶标记技术专著）。
（4）包被液、稀释液、洗涤液和底物溶液配制参考一般方法。
3．方法 各反应物最适合工作浓度经方阵滴定法确立。将鼠抗人Fn－McAb，（或明胶溶液用包被液稀释成20mg／L），包被聚苯乙烯反应板，每孔100μl，4℃过夜经洗涤液洗3×3min，加待测标本（标本稀释度经方阵滴定后确立）10μl及Fn含量分别为300mg／L、250mg／L、150mg／L、100mg／L、50mg／L的标准参考品，每孔100μl，37℃1h后，3×3min洗涤，再每孔加最适稀释度的HRP－鼠抗人Fn100μl，37℃1h后，3×3min洗涤，每孔加新鲜配制底物溶液100μl，37℃15～30min后，加2mol／L H2SO2终止反应。用酶标比色计测492nm A值，查Fn标准参考品曲线，即得Fn含量。
4．参考值 成年人血清Fn含量（231±46）mg／L，略低于血浆Fn含量（210～447mg／L），无性别差异，老年人Fn含量偏低。脑脊液中Fn含量＜5mg／L。
5．临床意义 Fn含量的变化与多种疾病的严重程度和转归相关。
结核患者血清Fn含量为（181±47）mg／L，明显低于正常人。尤其是肺结核合并感染或合并糖尿病者更为明显。
90%肝硬化等所致漏出性胸腔积液（或腹水）中Fn含量小于80mg／L，渗出性胸腔积液（或腹水）中Fn含量大于80mg／L，其中结核性胸腔积液（或腹水）Fn含量最高，平均为（190± 59）mg／L。恶性肿瘤所致胸腔积液（或腹水）中Fn为（156±55）mg／L。
脑脊液中含量Fn含量测定对结核性脑膜炎的诊断价值，还有待于进一步探讨。
（綦迎成 刘 泓）
［1］熊礼宽．结核病实验诊断学．北京：人民卫生出版社，2003
［2］江载芳，易著文．实用小儿结核病学．北京：人民卫生出版社，2006
［3］吴雪琼．结核病的免疫学诊断．结核病健康教育，2009，2：46－49
［4］霍霏霏，刘晓清．结核病免疫学诊断新进展．中华实验和临床感染病杂志（电子版），2010，5：48－50
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