尿中抗结核药物的定性测定

一、异烟肼

异烟肼（INH）为含氨基的化合物，对MTB具有选择性高、抗菌力强、疗效高、毒性小、口服方便、价格低廉等优点而成为主要抗结核药物之一。其口服吸收快而完全，且吸收后广泛分布于全身体液和组织中，1～2h后血药浓度达到高峰。在体内，INH大部分在肝中被代谢为乙酰INH、异烟酸等，最后与少量原型药物一起经肾从尿中排泄，且尿中浓度高低基本与其血药浓度相平行，但其高峰浓度出现时间较血药浓度稍晚。

测定尿中INH及其代谢产物的方法很多，现介绍两种简便实用的测定方法，即乙萘醋磺酸钠法和硝普钠法。

（一）乙萘醋磺酸钠法

1．原理 乙萘醋磺酸钠在碱溶液中能与INH反应生成砖红色化合物。

2．试剂

（1）饱和乙萘醋磺酸钠水溶液。

（2）碱溶液，即0．4mol／L NaOH溶液，加入等体积的甲醛溶液，混匀后加入过量硼砂，使之成为饱和硼砂溶液。

3．方法 取尿液1ml，加1滴乙萘醋磺酸钠溶液；混匀后加2滴碱溶液。

4．结果判读 1min内尿液变红色者为测定阳性。

5．注意事项

（1）乙萘醋磺酸钠溶液应临用前配制，当天使用。

（2）本法最适pH为10左右，1min内完成显色反应。若尿液酸性过强，则可多加1～2滴碱溶液继续观察，此时显红色者仍应判读为阳性。因此，对于阴性标本必要时应用pH试纸检测标本的pH而后再行测定。

（3）结果判读时间应在1min之内，时间太长则会因乙萘醋磺酸钠可能与尿中吲哚类物质反应而使尿液变红，进而干扰结果观察甚至产生假阳性结果。

（4）PAS亦能与该反应中的试剂作用，但其在中性溶液中也能进行鉴别。

（5）对短程化疗患者，尿液留取时间以服药后6h以内为宜。

（6）为提高该法检测的灵敏度或排除深色尿液的干扰，可取2份尿液标本，第1份尿液标本操作同上，第2份标本则先加碱溶液，混匀后再加乙萘醋磺酸钠溶液，如第1份标本的显色深于第2份标本，则可判读为检测阳性。其原因可能是在碱性条件下，INH容易与甲醛反应生成甲醛异烟腙，而干扰其与乙萘醋磺酸钠的反应，因而显色较浅。

6．临床意义

（1）有助于了解不住院患者在家的服药情况。

（2）有助于了解患者短程化疗结束后是否继续用药。

（3）为调整治疗用药剂量和给药间歇时间提供参考。

（二）硝普钠法

1．原理 在酸性条件下，INH及其一些代谢产物能与硝普钠即亚硝墓铁氰化钠作用生成橙至棕色化合物。

2．试剂

（1）碱性硝普钠溶液称取50mg硝普钠溶于5ml的0．4mol／L NaOH溶液中。

（2）乙酸溶液，即取1体积冰乙酸与2体积蒸馏水混合即成。

3．方法

（1）置6滴尿液于小坩埚内，加2滴碱性硝普钠溶液，轻轻摇匀使成鲜黄色。

（2）再加2滴乙酸溶液摇匀。

4．结果判读 在1～5min尿液由鲜黄色变为橙至棕色者，视为检测结果阳性。如果在5min内只使鲜黄色消退而不变为橙至棕色，即为阴性。

5．注意事项

（1）碱性硝普钠溶液宜新鲜配制，在夏天应在配制后1～2h应用，冬天则可在室温下保持稳定数小时。

（2）吡嗪酰胺、环丝氨酸等对本法有呈色干扰，应予注意。

（3）尿标本时间同前。

（4）本法的试剂用量与化学试剂质量很有关系，因此在不同的实验室或换用其他药厂生产的试剂时，宜先摸索最佳试剂用量方能进行正式临床检验。

6．临床意义 同乙萘醋磺酸钠法。

二、利福平

利福平（RFP）是一种由Maggi于1965年合成的对细胞内外的MTB都有明显杀菌作用的药物，不溶于水，易溶于三氯甲烷等有机溶剂。其口服吸收率高，易渗入机体组织和体液，于1～2h可达血药高峰浓度，口服常用剂量后有效血药浓度可维持8～12h，在肝内代谢为去乙酰基RFP，其仍具抗菌活性。但反复用药后，因可诱导肝药酶活性而加快其自身在体内的代谢。其主要从胆汁排泄，形成肝肠循环，约30%左右经尿液排出。

1．原理 RFP易溶于有机溶剂，不易溶于水。因此，可利用有机溶剂将尿液中的RFP及其代谢产物浓缩抽提出来，再观察有机相是否呈红色来进行判断。

2．试剂 三氯甲烷。

3．方法 取尿液1～2ml于试管中，加5～6滴三氯甲烷，摇动试管，观察沉于试管底部的三氯甲烷层的颜色。

4．结果判渎 若三氯甲烷层呈现红色，则视为RFP检测阳性。

5．注意事项

（1）尿中脂溶性胆红素、抗结核药物乙硫异烟胺的存在可能影响结果判读。

（2）标本取样时间最好在服药后3～12h。

（3）送检标本最好即行检验，放置时间不宜过长。

6．临床意义 同异烟肼。

三、吡嗪酰胺

吡嗪酰胺（PZA）是烟酰胺的衍生物，其在酸性条件下抗菌作用最强，为细胞内有效杀菌药，在现代结核病短程化疗中为基本抗结核药物。其口服吸收迅速，广泛分布予各种组织和体液，2h血药浓度达到峰值。在体内，其经过肝脏的生物转化，代谢为POA，约70%经肾由尿液排出，排出形式主要是POA和PZA。因而可以通过检测尿中的POA和PZA来判断其血药浓度。

（一）POA的测定

1．原理 POA与Mohr盐结晶起反应，在pH 4～7时产生橙红，最大吸收峰波长在460nm。

2．试剂

（1）50%H2SO4溶液。

（2）Mohr盐（硫酸亚铁铵结晶）。

（3）饱和乙酸铅。

3．方法

（1）取10ml尿液加入1ml饱和乙酸铅，摇匀，经每分钟2 000转离心2min。

（2）取上清液8ml，加50%H2SO4溶液0．1ml，同离心。

（3）取上清液3ml于试管，再用pH试纸调pH至4～7后，加入少许Mohr盐。

4．结果判读 若溶液呈现橙红色，则示尿液中有POA存在，是为阳性结果。

5．注意事项

（1）加入饱和乙酸铅是为了去除尿液色素干扰，故一定要混合均匀。

（2）加50%H2SO4溶液是为了除去反应体系中过多的铅。

（3）若标本中POA为微量，则可取方法中第二步骤的上清液3ml再加入1滴50%KOH，100℃加热1h，再按方法中的步骤3进行检验。这时尿中的PZA可分解为吡嗪酸。

（4）标本留取时间最好在服药后3～6h。

6．临床意义 同异烟肼。

（二）PZA测定

1．斑点法

（1）原理：硝普钠（又称亚硝基铁氰化钠）在碱性溶液中与PZA反应生成红色化合物。

（2）试剂：SNP（sodium nitro pentacyanoferroate）试剂2g Na2［Fe（CN）5NO］·2H2O溶于100ml 2mol／L NaOH溶液中。

（3）方法：于白色半圆形凹形瓷盘孔内加尿液3滴，再加SNP试剂1滴，轻轻摇匀，于3min内观察结果。尿液颜色由黄色变为橙色者为尿PZA阳性。

（4）注意事项：SNP试剂应4℃避光保存于棕色瓶中。每次配制可用2周，逾期应重新配制。

（5）临床意义：同异烟肼。

2．滤纸法

（1）原理：同斑点法。

（2）试剂：称取Na2［Fe（CN）5NO］·2H2O 4g溶于16%的NaOH溶液中即成。

（3）方法

①将滤纸浸入上述试剂溶液中并立刻取出在室温下吹干。

②将上述含试剂的干燥滤纸浸入尿液中，立即取出，观察结果。

（4）结果判读：若滤纸在2min内由黄变红，则示尿中PZA阳性。若不变色则为阴性。

3．Acetest片剂法

（1）原理：该片剂含有硝普钠、乙酸铵和磷酸二氢钠，其与PZA反应生成红棕色化合物。尿液颜色由黄色变为橙色者为尿PZA阳性。

（2）试剂：Acetest片剂。

（3）方法：在清洁干净的白板上放一片Acetest片剂，加尿液1滴于片剂表面，待尿液吸干后2min内观察结果。

（4）结果判读：若2min内呈现红棕色则示尿中存有PZA。

（5）注意事项：若尿液存放时间过长，则需结果观察时间延长至10min左右。

四、乙胺丁醇

乙胺丁醇（EMB）于1959年合成，1961年证实其对MTB有抑菌作用，长时间都被列为抑菌药。近年来则发现其对细胞内外的MTB都有较强的杀菌作用，且对耐SM和耐INH的MTB仍然有效而被列为结核病化疗的一线药物。EMB经口服后能迅速从胃肠道吸收，经机体生物转化后70%左右以原型从尿中排出，因此可从尿中检测EMB。

（一）Lederle法

1．原理 在中性溶液中，溴百里香酚蓝能与EMB反应生成黄色化合物。

2．试剂

（1）5mol／L pH7．0PBS液。

（2）1%溴百里香酚蓝100mg溴百里香酚蓝溶于100ml 0．5mol／L pH7．0PBS液中。

（3）苯。

（4）EMB标准液50μg／ml。

3．方法 取患者尿液1．0ml加0．1%溴百里香酚蓝1ml，随后加苯4ml振荡数分钟，同时用EMB标准液作对照。

4．结果判读 标准对照与苯层同呈深黄色者为阳性，苯层呈绿色者则为阴性。

5．注意事项

（1）RFP、利福定等红色或黄色药物也能被苯萃取而影响鉴定，可用三氯甲烷或异戊醇将其他药物抽提后再行EMB鉴定。

（2）溴百里香酚蓝也是pH指示剂，在与EMB反应的同时，本身颜色也随溶液pH的变化而变化。在做检测时应将尿液pH调至中性方可得到可靠结果。

（二）荧光检测法

1．原理 尿中EMB经三氯甲烷提取后，在紫外光下产生荧光。

2．试剂

（1）4mol／L PBS液（pH7．2）。

（2）三氯甲烷。

（3）2%铁氰化钾水溶液。

（4）0．1mol／L NaOH溶液。

（5）冰乙酸。

3．方法

（1）于试管中加入尿液5ml，PBS缓冲液0．5ml和三氯甲烷5ml，用力摇匀后，经每分钟2 000转离心5min。

（2）将三氯甲烷层移入另一试管，于该试管中加入1ml铁氰化钾溶液和1ml 0．1mol／L NaOH溶液，用力摇匀后，再用移液管加冰醋酸1ml，混匀。

（3）在暗室中以棕色纸为背景用紫外光直射试管。

4．结果判读 产生蓝色荧光者示尿中EB阳性。

5．注意事项 2%铁氰化钾水溶液应临用时配制。

6．临床意义 同异烟肼。

五、对氨基水杨酸

对氨基水杨酸（PAS）为浅黄色或白色结晶性粉末，易溶于水但在水中不稳定，其因能抑制MTB中对氨基苯甲酸的合成而对MTB有抑菌作用，与其他抗结核药物联用可增强疗效并延缓耐药性的产生，因而亦常被现代化疗方案所采用。其口服吸收良好，在体内约有50%的药物乙酰化，80%的药物（包括其代谢物）在10h内从尿中排出。

（一）对二甲氨基苯甲醛显色法

1．原理 PAS与对二甲氨基苯甲醛在酸性水溶液中反应生成黄色化合物，若含量太高，还可能有沉淀析出。

2．试剂 3%对甲二氨基苯甲醛溶液。

3．方法 取尿液1～2ml，加1滴3%对甲二氨基苯甲醛溶液，观察尿液的颜色变化。

4．结果判读 尿液立即变黄甚至出现黄色沉淀者为PAS阳性，呈浅黄色者为阴性。

5．注意事项

（1）尿中胆红素可与此试剂发生反应但呈色很淡，有时需要区别。

（2）本取样最好在服药后2～6h进行。

（二）Ehrlich试纸法

1．原理 同对二甲氨基苯甲醛显色法。

2．试剂 Ehrlich试纸，即取对甲二氨基苯甲醛2g溶于100ml 10%草酸溶液中，再将试纸浸入湿透，取出烘干，切成小条即成。

3．方法 取尿液5ml于试管中，加6mol／L HCl 1．0ml，水浴中加热10min后投放试纸，观察试纸的颜色变化。

4．结果判读 试纸变橘红色或橙色者为PAS阳性。

5．注意事项 INH可干扰此反应淡粉红色或暗褐色，需要鉴别。

6．临床意义 同异烟肼。

六、环丝氨酸

环丝氨酸（CS）易溶于水，口服吸收良好，可广泛分布于全身体液和组织中。大部分以原型从尿中排出。

（一）硝普钠法

1．原理 CS在酸性条件下能与硝普钠反应生成蓝色化合物。

2．试剂

（1）4%硝普钠水溶液。

（2）4mol／L NaOH溶液。

（3）3mol／L乙酸溶液。

3．方法 于试管中加入3ml尿液及1ml试剂（1）和试剂（2）的等体积混合液混匀。

4．结果判读 若溶液呈现蓝色，则视为尿中CS阳性。

5．注意事项

（1）若尿液不足3ml，应加水至相应体积。

（2）若尿液颜色较深或CS含量太少，可加少量活性炭脱色。此法还可吸附尿中的PZA以消除基干扰。

6．临床意义 同异烟肼。

（二）斑点法

1．原理 同硝普钠法。

2．试剂

（1）SNP试剂同PZA斑点法。

（2）1mol／L HCl溶液。

3．方法 滴加3滴尿液于凹形白色瓷盘的孔内，随后加1滴SNP试剂，混匀后再加2滴1mol／L HCl溶液混匀。

4．结果判读 出现蓝色者为尿液CS阳性。

七、乙硫异烟胺

乙硫异烟胺（TH1314）为黄色结晶粉末，几乎不溶于水，口服易吸收，并分布于全身，在体内大部分失活后由尿中排出。其主要用Eidus法检定。

Eidus法，即取尿液8ml，加枸橼酸钠3滴，三氯甲烷10滴，振荡后离心，取三氯甲烷层加0．1mol／L HCl 0．8ml，再振荡，然后取酸层液10滴于白瓷皿上，呈黄色者为阳性。

八、利福定（RFD）

1．原理 同利福平（RFP）。

2．方法及结果判读 与RFP相同，但尿液底层的氯仿层呈黄色即为阳性，反之（无色或白色）即为阴性。

3．注意事项

（1）尿中若有TH1321存在，可能出现假阳性。因TH1321及其代谢产物（亚砜）也是黄色，同样可被氯仿提取。

（2）未服药者，尿液即使很黄，因不能被氯仿所提取，则不会产生假阳性。尿中脂溶性胆红素增高者除外。

（3）尿液收集后，应及时鉴别，否则时间过久RFD不稳定，容易自发氧化，生成利福定醌，其颜色变为暗绿色。此时，可在尿液中加入少许（几毫克）维生素C，使之还原为RFD后再行鉴定，仍可得到满意的结果。

（4）RFP在尿中比RFD稳定，难以氧化，且尿液中含量较多，故尿液存放时间稍长一点影响不大。