体液内抗结核药物的生物学测定法

测定体液内抗菌药物浓度的方法，有化学测定法和生物学测定法两种。化学测定法虽较精确，操作也比较简便，但是，需要有较贵重的仪器，如光电比色计、分光光度计、荧光光度计等设备，且所用待测液体量较多，加之其测定结果易受血清、体液内其他成分等因素影响，采用同一种化学测定法又不能应用于对血清、尿液及痰液等体液内药物浓度的测定，必须是不同体液用各自化学测定方法。所以目前多采用生物学测定法。

药物的生物学测定是利用药物能抑制敏感菌的生长这一特点而设计的。由于其敏感度较高且和临床的情况亦较符合，加之不需用特殊设备和试剂，只要能开展分枝杆菌培养的实验室均可进行，因而得到广泛应用。

下面就链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、卷曲霉素、卡那霉素等抗结核药物的体液内药物浓度的生物学测定方法介绍如下。

一、体液中链霉素测定

链霉素（SM）是美国瓦克斯曼（Waksman）于1944年从灰色链霉菌的培养液中提取出来的。几乎不溶于醇、氯仿或乙醚等有机溶剂，易溶于水。链霉素对多种革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、产气杆菌、肺炎杆菌、沙门菌属、痢疾杆菌、嗜血杆菌属、布氏杆菌等及某些变形杆菌和极少数铜绿假单胞菌均具有抗菌作用，在革兰阳性细菌中对某些葡萄球菌有抗菌效果，而在革兰阳性杆菌中链霉素对结核菌具有强大的抗菌效能，是抗结核治疗中首选药物之一。在现代结核病的短程化疗中作为一线药物。

口服SM基本上不能被吸收，大部分以原型由粪便排出。链霉素一般采用肌内注射，肌内注射后30min至3h内血清浓度达到最高峰。正常人肌内注射链霉素0．5～1．0g后，血清内的最高浓度可以达到20～40μg／ml。一次肌内注射链霉素0．5g后，血液内有效浓度可以维持12h。链霉素大部分随尿液排出体外，而在第一个24h内的排出量最多（当然个体的差异很大），为用药量的30%～90%。链霉素的排泄主要是肾小球的滤过作用，而不受阻断肾小管分泌药物的影响。如肌内注射链霉素0．5g后，尿中平均浓度可以达到300～400μg／ml。链霉素很容易渗入胸腔和腹腔内，当胸膜和腹膜发炎时，渗透率明显增加，其中浓度几乎与血液内浓度相等。一次性胸腔内给药500mg，最高血液浓度可在0．5h内达到5～50μg／ml。链霉素主要分布在细胞外，不容易透入细胞内。正常脑脊液中的分布也比较少或不进入脑脊液及厚壁脓肿，所以不能达到有效治疗浓度。

链霉素体液内浓度测定方法，常用的是圆筒平板法，亦称牛津小杯法，是1941年牛津大学阿伯拉罕（Abraham）等所创用于测定青霉素，随后沿用此法测定体液内抗生素浓度。测定方法的原理系根据抗生素可以从圆筒内渗入到其周围的琼脂培养基内，而在圆筒周围的培养基上出现一抑制细菌生长的圆形圈。当抗生素在一定浓度范围内，抑菌圈大小与圆筒内液体所含抗生素的浓度多少成比例。与已知浓度的标准抗生素液体测得的抑菌圈大小相比较，求出测定液体内抗生素的含量。

1．原理 抗生素如SM等可从圆筒内渗入到周围的琼脂培养基内，而抑制圆筒周围培养基上敏感细菌株的生长而形成一抑菌圈；而且在一定的药物浓度范围内，抑菌圈的大小与圆筒内液体中所含抗生素的含水量成正比。其与已知浓度的标准抗生素测得的抑菌圈大小柱比较，即可求得待测液体内抗生素的浓度。

2．材料

（1）玻璃平皿：直径9cm。

（2）圆筒：不锈钢材料制作，内径0．6cm，高1．0cm。

（3）实验菌液：取标准金黄色溶血性葡萄球菌接种于血琼脂培养基，37℃孵育16～24h，挑取生长良好的菌落一接种环，转种于10ml普通肉汤管内，混匀后，再37℃孵葛16～18h，取此培养液0．1ml，再接种于10ml普通肉汤培养管内，37℃孵育16～24h，好为试验菌液。

（4）培养基：牛肉膏1．5g、酵母浸膏3．0g、蛋白胨6．0g、氯化钠3．0g和琼脂20．0g溶于1 000ml蒸馏水中，以10%NaOH调pH至7．8～8．0，分装后102．9kPa灭菌25min，取出待凝固后置冰箱4℃保存。

（5）1%菌液培养基：取上述培基熔化后冷至50～60℃按1∶100的体积比向培基中加入实验菌液，混匀待用。

（6）实验用琼脂平皿：取4℃保存培基熔化，加8ml平铺于平皿内，待凝固后，在此培基上加入1%菌液培养基5ml迅速均匀平铺于其上，取无菌干燥圆筒放于培养基上，每一平皿可放置6个圆筒。

3．方法

（1）制作标准曲线：用分析天平称取硫酸链霉素128mg（相当于SM 100mg），以无菌生理盐水稀释为0．5μg／ml、1．0μg／ml、2．0μg／ml、5．0μg／ml、10．0μg／ml、20．0μg／ml和30．0μg／ml药液，由低到高浓度依次加入0．3ml于上述实验用平皿的圆筒内置37℃培养16～18h，每一浓度药液做2次测定，然后以SM含量为横坐标，以2次测定的抑茵瞬直径（mm）的平均值为纵坐标绘制标准曲线。

（2）无菌操作取标本：血标本应无菌操作分离血清、尿液标本应用无菌蒸馏水稀释100倍、痰液应用木瓜酶消化，其他诸于脑脊液、胸腔积液、腹水、脓液和支气管灌洗液等则无需进一步处理。

（3）按标准曲线制作的测定方法测定标本的抑菌圈直径大小，尔后查标准曲线即可得出待测标本中的SM浓度。

4．注意事项

（1）实验用琼脂乎皿制作时培养基厚度一定要均匀且不能有气泡。

（2）测试标本时最好在每一平皿内同时作一标准药物浓度的质控液，可资校正。

（3）标本的测定条件应尽可能与标准曲线的制作条件保持一致。

（4）标本留取时间宜在服药后2～12h。

二、体液中异烟肼测定

异烟肼（INH）由马尔（Mayer）于1912年最先合成，直到1952年Grunberg等方才发现其有抗结核分枝杆菌作用。其难溶于醚，微溶于醇，能溶于水，还原性强，易受光线、重金属和温度影响产生氧化还原反应而变色。故应避光避湿密闭保存。异烟肼是含有氨基的药物，凡含氨基的药物服用后，在肝经过乙酰化作用而解毒，即失去药物活性，也失去抗结核菌作用。异烟肼形成乙酰化合物后几乎全部从肾排出。异烟肼乙酰化的能力，个体的差异也很大。INH口服后吸收迅速而完全，1～2h后血液中可达高峰，且广泛分布于全身。INH大部分乙酰化后由尿中排出。在服用异烟肼后，在一定时间内测定血清浓度，确定标准范围，划分出快失效型、中间型及慢失效型。

1．原理 INH浓度的生物学测定常用直立扩散法。直立扩散法是利用药物沿培养基渗透扩散作用在与细菌接触之间，形成抑菌带，抑菌带大小与测定标本内药物含量（药物浓度在一定范围内）成正比。测定得的抑菌带高度与已知标准异烟肼浓度抑菌带高度相比较，求出测定标本内异烟肼含量。

直立扩散法测定药物浓度原理与链霉素浓度测定的小杯法基本相同。小杯法是平板扩散，测定抑菌圈直径大小，而直立扩散法是由下向上扩散，测定抑菌带的高度。

2．材料

（1）18mm×180mm试管。

（2）改良L－J培养基。

（3）实验用菌株H37Rv、BCG、AFBH7菌株均可。

（4）实验菌液接种实验菌液于改良罗氏培养基上，菌落长出后用毛细吸管吸取菌落少许置于含有0．5%吐温80生理盐水的试管内壁上用细玻璃棒研磨，直至菌落呈乳状液体，再用毛细吸管轻轻吸入0．5%吐温80生理盐水内，用标准比浊管作对照，再用灭菌生理盐水稀释成1mg／ml的菌液，尔后继续稀释至0．01mg／ml的菌液备用。

（5）实验用培养基取实验菌液0．2ml接种于改良罗氏培养基斜面平放于实验台上，静置30～40min，使菌液均匀分布于培养基斜面，尔后以毛细吸管从试管底部吸取多于菌液，直立于试管架上供试验用。

3．方法

（1）制作标准曲线：①取纯品INH40mg加灭菌蒸馏水5ml溶解，而后用无药物血清稀释成4．00μg／ml、2．00μg／ml、1．00μg／ml、0．50μg／ml、0．25μg／ml、0．125μg／ml及0．0625μg／ml的INH标准液。②取标准液1．0ml，从低浓度到高浓度依次加入实验用培养基的试管底部，直立试管放置37℃培养3d后观察结果，测定抑菌带高度，以INH含量为横坐标、抑菌带高度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）标本测定：空腹口服INH 0．3g后，于1h、2h、4h和8h静脉取血3．0ml，无菌条件下分离血清。取血清1．0ml，接种实验用培养基，如同标准曲线操作，测定其抑菌带的高度，查找标准曲线便可得标本中INH的含量。同时应以标准液和蒸馏水作为对照。

4．注意事项

（1）培养基厚度应尽量一致且厚度适宜。在试管大小和培养基的量一定时，培养基斜面厚者抑菌带短，斜面薄者抑菌带长。从方法的灵敏度考虑，抑菌带长者为好，但斜面过薄又会因营养不足而影响菌株的生长。现一般用18mm×180mm管，培养基装量4～5ml，斜面长度110mm左右。

（2）接种菌液时不要把样品滴在培养基表面或试管壁上，一定要滴加到试管底部。

（3）接种后的试管要立刻直立，不能斜倒。

（4）标本采集后最好立即接种。若不能即时接种，可冰箱4℃保存，但不要超过1周。

（5）因为H37Rv、BCG生长太慢，为加快检测，临床检测最好用FBH7菌株。

三、体液中利福平浓度的测定

利福平（RFP）的体液浓度与最低抑菌浓度的比例中说明它仅次于异烟肼而优于链霉素（表6－3）。

在用药方法上，利福平可以口服，而且易于吸收。因此，血液中的浓度在初期可以很高，由于肝胆循环的缘故，下降也是缓慢的。所以，其治疗浓度可以维持达12h或更久。

利福平在血液内与血浆蛋白结合，其结合率为75%～80%。口服利福平后迅速分布至全身各脏器及体液内，尤以肝、肾与肺内的浓度为最高。例如，口服利福平150mg后，这些脏器内可以分别达到3．6μg／g、3．95μg／g和4．08μg／g组织。利福平可以到达胸腔积液、腹水及痰内，胸腔积液、腹水内的高峰浓度在用药后的6～8h，其浓度约为血液浓度的1／3。利福平渗入脑脊液的量很少，约＜0．5μg／ml，而当脑膜有炎症时，在服药后6h，脑脊液内的浓度可以上升到1．5～2．5μg／ml，相当于血液中高峰浓度的1／5左右。

表6－3 各种抗结核药物的血内浓度及最低抑菌浓度

利福平主要由胆汁和尿液排出。因此，胆汁中的浓度很高，可以达到同时间血液浓度的5～20倍或以上。胆汁中的排泄量与用药剂量有关。当口服利福平150mg后，主要从胆汁排泄，当剂量增加至450mg时，由于胆汁排泄能力的限制，尿液内的排泄量逐渐增多。因为部分的利福平在肠道中重吸收后再从胆汁排出，最终在粪便内的排出量约占给药量的60%。尿液内的排泄率平均为给药量的18%～30%。在口服450mg后，0～6h利福平从尿液内的排出量最多，平均尿液内浓度可以达到160μg／ml。

利福平体液内浓度测定方法比异烟肼浓度测定方法广泛得多。由于RFP不仅有良好的抗结核作用，而且对革兰阳性菌有强大的抗菌活性，因而可用K－B法应用其他细菌（如八叠球菌、金黄色溶血性葡萄球菌等菌株）做RFP的含量测定。

随着口服利福平剂量的增加，血液内的浓度也按比例增加。利福平口服后迅速地被吸收入血液内。口服后1h的血浓度最高，4h后逐渐降低，在6h后明显降低，至24h血内利福平浓度几乎降低到零。随着利福平剂量的增加，血液内浓度也增加。

1．原理 将含有一定量的RFP药物纸片平贴在已经接种有关细菌的培养基上，纸片中的RFP即向琼脂周围扩散，敏感菌株在纸片周围的生长则受到抑制而形成抑菌圈。抑菌圈的直径大小则与药物纸片上RFP的浓度成正比。

2．材料

（1）载药纸片：6mm直径灭菌滤纸片。

（2）培养基：称取蛋白胨10．0g、牛肉膏3．0g、氯化钠5．0g、酵母浸膏2．0g和琼脂20．0g，溶于1 000ml蒸馏水中，待全部溶解后调pH至7．4，分装后102．9kPa灭菌20min，凝固后冰箱4℃保存备用。

（3）实验用培养基平皿将上述培养基熔化后约取25ml倾注于9cm平皿中，使培养基深度达4～6mm。制成的平皿可在冰箱内4℃保存约1周。

3．方法

（1）制作标准曲线：①取RFP 30mg，加甲醇1．0ml溶解后，加灭菌生理盐水2．0ml，及再继续稀释至每毫升含RFP 0．1mg。然后用pH 7．3的1／15mol／L的PBS液稀释至0．03μg／ml、0．05μg／ml、0．10μg／ml、0．50μg／ml、1．00μg／ml、5．00μg／ml和10．00μg／ml。②用无菌滤纸浸湿标准液，35℃晾干后贴于实验用培养基平皿的琼脂上，37℃培养10～16h，测定抑菌圈直径的大小，然后以RFP浓度为横坐标、抑菌圈直径（mm）为纵坐标绘制标准曲线。

（2）标本收集及处理：①血液标本。口服450mg或按体重（kg）计算重量后，按规定时间留取标本。静脉采血后无菌操作分离血清。若不能立即测定则应冰箱内保存。测定时血清应用1／15mol／L pH7．3的PBS缓冲液稀释，稀释倍数则根据血清内RFP的含量而定。一般第一、二次采血的血清标本2倍稀释即可。②尿液标本。留取标本时应准确量取尿量，混匀后部分尿液送实验室测定。尿液稀释用1／15mol／L pH7．3的PBS缓冲液稀释8倍。如果尿液中药物含量较低，则可降低稀释倍数或不稀释。③痰标本。加2倍体积的1%木瓜酶振荡摇匀后37℃温箱内消化30min，离心取上清液进行测定。

（3）标本测试：取准备好的标本按标准曲线制作实验步骤进行测定。根据测量的抑菌圈的大小从标准曲线上求得标本中RFP的含量。同时在每一测定标本的平皿内设置标准液对照。

4．注意事项

（1）实验培养基平皿在从冰箱取出使用前须在35℃温箱内放置约30min，以除去琼脂板表面的水分。

（2）滤纸片在浸标准药液或检测标本后一定要在35℃左右的室温下晾干，否则纸片上的含药量很难一致而不标准化。

（3）每一个标本测试培养皿一定要同时做一个标准液以资对照，便于校正。

四、体液中乙胺丁醇含量的测定

乙胺丁醇（EMB）是一种化合物，极易溶于水。口服后吸收良好，有75%～80%的口服剂量从肠道吸收，进食后对其吸收和血液浓度的影响不大。乙胺丁醇口服后2～4h血液的浓度可以达到高峰，例如口服剂量为15mg／kg、25mg／kg、50mg／kg时，2h的血液浓度分别为3μg／ml、5μg／ml、10μg／ml，8h的血液浓度为高峰浓度的50%，而24h后的血液浓度为高峰浓度的10%。红细胞是乙胺丁醇的储藏所，其中含药浓度可以达到血清浓度的3倍以上，并且能够缓慢地释放进入血液循环。但是，乙胺丁醇和某些抗结核药物同样不容易透入正常人的脑脊液中，而在脑膜发生炎症时，口服25mg／kg后，3h脑脊液内乙胺丁醇含量可以达0．5～2μg／ml，平均为1μg／ml，只相当于同时间血液浓度的15%～25%。

乙胺丁醇吸收后，排泄比较缓慢，主要从尿液和粪便中排出。口服乙胺丁醇后血液中浓度，以2～4h为最高，口服后24h，乙胺丁醇口服剂量的50%从尿液排出，20%从粪便排出。从尿液排出的乙胺丁醇有90%为原型药物，其余10%为已在体内被代谢成酸或醛类的衍生物。

1．原理 关于乙胺丁醇血液浓度的测定方法，在1963年Schmidt应用比色方法测定血液浓度报道后，虽然经过研究者们的应用和改进，但是由于乙胺丁醇代谢产物等的影响，致使化学方法的技术比较复杂，而所测定的结果不够敏感。所以，乙胺丁醇体液内浓度的测定方法，仍然以生物学测定法为常用。EMB浓度的生物学测定常用直立扩散法和圆筒平板法。下面以圆筒平板法为例进行介绍。

2．材料

（1）Kirchner琼脂培养基：称取磷酸二氢钾1．4g、磷酸氢二钾0．3g、枸橼酸钠0．25g、硫酸镁0．06g、天冬酰胺0．50g和琼脂2．0g溶于100ml蒸馏水中，并向其中加入1．5ml甘油和0．25ml 0．1%的孔雀绿，充分混合溶解后调pH至7．0，而后102．9kPa间歇灭菌20min，间歇灭菌连续3d，待冷却至50～55℃时，加入马血清100ml混匀于冰箱4℃保存备用。

（2）实验用菌液：取AFBH7菌落接种于Dubos液体培养基内，在试管壁上磨成碎菌块，37℃温箱培养16～24h，取上层菌液稀释成0．5%备用。

（3）试验用培养基：取Kirchner琼脂培养基熔化，加10ml于9cm平皿内，待凝固后取实验菌液2ml，均匀接种在平皿培养基上，用毛细吸管吸去多余菌液，待培养基面稍干后加圆筒备用（具体操作见SM测定）。

3．方法

（1）制作标准曲线 ①取EMB纯品20mg。加灭菌蒸馏水稀释至0．1mg／ml，再以血清稀释成40μg／ml、20μg／ml、10μg／ml、5μg／ml、2．5μg／ml和0．625μg／ml的药物标准液。②无菌操作吸取EB标准液0．3ml按不同浓度分别加入制备好的圆筒内，放入37℃培养。③培养2d后测定每圆筒周围抑菌圈的直径，而后以EMB标准液的浓度为横坐标、抑菌圈直径（mm）为纵坐标绘制标准曲线。

（2）标本收集及处理嘱患者早晨按25mg／kg体重口服EMB后，于1h、2h、4h、8h取血液标本，之后无菌操作分离血清；痰标本则于上述剂量服药后1h、3h、5h、7h、9h和11h留取，之后用1／10痰体积的5%木瓜酶在42℃水浴内消化痰液30min，再加热10min，而后离心15min取上清液测定。

（3）标本测定测定方法同标准曲线制作，之后查标准曲线即可求得标本中EMB的含量。不过每一标本测定的平皿内均须用EMB标准液作对照。

4．注意事项 同链霉素测定。

五、体液内卷曲霉素浓度的测定

由于卷曲霉素（CPM）容易被胃酸所水解，并且口服后吸收极少，所以口服无效。因此卷曲霉素的用药方法为肌内注射。卷曲霉素肌内注射后吸收较快，血液浓度高峰出现在1～2h。说明卷曲霉素肌内注射后，吸收迅速而且血液浓度也比较高。在同样用药情况下，尿内卷曲霉素浓度高峰，与血液浓度高峰时问基本相同，排出量最多是在1～2h。说明卷曲霉素吸收比较快，而由尿液内排出量也比较快。卷曲霉素肌内注射后2h排出量占24h总排出量的44%左右。在给药后24h内从尿液内排出卷曲霉素量占给药量的60%左右。痰液内卷曲霉素测定，在用药后1h即可测出痰内含药浓度，但是大部分痰标本内卷曲霉素含量甚微。

1．原理 用生物学方法测定CPM血液内的浓度。应用非病原性抗酸菌H7株及B、Subtilis PCL测定CPM血液浓度，也有用枯草杆菌ATCC 6633株测定体液内CPM的浓度。扩散法包括直立扩散法和小杯扩散法。卷曲霉素体液内浓度的测定，以直立扩散法为优，也可采用小杯法。

2．材料

（1）磷酸盐缓冲液（pH7．8～8．0）：取磷酸二氢钾0．523g，磷酸氢二钾16．713g，加蒸馏水1 000ml即可。

（2）培养基：①直立扩散法用培养基，见异烟肼体液内浓度测定。②小杯法，ATCC 6633菌株用培养基。

（3）菌液配制：取ATCC6633菌株接种于普通琼脂斜面，在37℃培养24h后，转种于克氏瓶培养基（每一克氏瓶内加入琼脂培养基40～50ml），接种要均匀，以便获取比较多量菌落。在37℃温箱培养7d后，用15ml灭菌生理盐水洗下菌苔，把各克氏瓶内菌液均集中于一个容器内，记下菌液量。尔后用灭菌生理盐水洗涤菌液1～2次，每次洗后以每分钟3 000转离心20～30min，最后一次离心后去上清液，加灭菌生理盐水至原菌液量。在65℃保温30min后，放冰箱内保存备用。

（4）实验用培养基的制备：在制备培养基前，实验台上应放一块大玻璃板，用水平尺校正水平后供制作培养基用。挑选平底平皿，放于校正水平后的实验台上。琼脂培养基溶解后，取10ml加入平皿内，迅速均匀流满平皿。待凝固后，另取已溶解的琼脂培养基冷至65℃左右，取制备的菌悬液按照0．5%菌量加入培养基内混匀，立即迅速取此含菌液培养基5ml，加入上述平皿内培养基上层，使加入的培养基均匀散布平铺在底层培养基面上。勿发生气泡或不均匀现象。凝固后为实验用培养基。

3．方法

（1）标准曲线绘制：准确称取卷曲霉素15mg（因1．5gCPM硫酸盐＝1．0gCPM），加磷酸盐缓冲液10ml，即得每毫升含CPM 1mg。再依次稀释配制成100μg／ml、50μg／ml、30μg／ml、20μg／ml、10μg／ml及5μg／ml的标准液，用小杯法测定。

取试验用琼脂培养基平皿，每一平皿内放小杯6个，于每个小杯内加标准液5～6滴（约0．3ml左右），至平杯口为宜。在37℃温箱培养14～16h取出，测定抑菌圈直径大小，以毫米表示。绘制成标准曲线图，编制标准液浓度表。

（2）标本采集和测定：血液标本，在无菌操作下分离血清，不须稀释直接测定。尿液标本，第1、2小时的标本按1∶80，第8小时的标本按1∶10，第24小时的标本按1∶2用磷酸盐缓冲液稀释后测定。测定方法及步骤均同标准液测定法。而在每个平皿内均需有标准液对照。根据实验需要选用适宜的标准液浓度，选用10μg／ml的标准液为对照。痰标本，留取痰标本后用1%木瓜蛋白酶稀释。在37℃温箱消化30min，用上清液测定。测定方法同血液标本。

4．注意事项

（1）放小杯时应通过火焰，但小杯不应过热，防止琼脂溶化。

（2）在无菌操作下采取血液、尿液标本，放入消毒容器内。留取尿液标本后混匀，取5ml送实验室测定。

六、体液内乙硫异烟胺浓度的测定

1．原理 乙硫异烟胺血液内浓度测定方法，1958年Rist等报道后，不少研究者进行了探讨和改进。但是，到目前为止，仍然用生物学测定法。

2．材料

（1）中试管18mm×180mm，或直立扩散试管，详见异烟肼体液内浓度测定

（2）培养基：①改良罗氏培养基。②Kirchner琼脂培养基。

（3）菌液制备：取H37Rv菌株，在鸡卵培养基于37℃温箱培养2～3周，用灭菌生理盐水配制成1mg／ml的菌悬液。再用灭菌生理盐水稀释至0．01mg／ml，取此浓度菌悬液为应用菌液。

（4）实验用培养基制备：取上述浓度菌液0．2ml，均匀地接种于上述培养基斜面上。平放于室内实验台上（使培养基斜面呈水平位置），静置1h左右，用灭菌毛细吸管吸去多余菌液，直立试管架上备用。

3．方法

（1）菌液比浊管配方：取0．25%氯化钡水溶液0．4ml，加2mol／L硫酸9．6ml混匀，其浑浊度相当于结核菌湿重1mg／ml的浊度。

（2）标准曲线绘制：由于乙硫异烟胺不溶于水，可溶于二甲亚砜等有机溶剂。称取乙硫异烟胺30mg，加二甲亚砜0．5～1．0ml，待完全溶解后，以蒸馏水稀释至1mg／ml。再以血清稀释配成0．3μg／ml、0．6μg／ml、1．2μg／ml、2．5μg／ml、5μg／ml、10μg／ml、20μg／ml、40μg／ml。

取上述乙硫异烟胺各浓度1ml，直接加入已接种菌液培养基试管底部。每个标准液浓度需要接种3支培养基试管。另取1ml生理盐水作为对照管。加完标准液后，把试管直立在试管架上，在37℃温箱培养2周后，测定抑菌带高度，绘制标准曲线图。编制乙硫异烟胺标准液浓度含量表，供临床试验用。

（3）临床试验：取乙硫异烟胺（片剂）0．5g，于早晨空腹顿服后，分别于2h、4h、6h、8h静脉采血，测定乙硫异烟胺含量。实验室收到血液标本后，应立即在无菌操作下分离血清，取血清10ml加入已接种菌液培养基试管底部。

4．注意事项

（1）如果用小杯法测定时，待培养基中加入血清后，立即吸取10ml，加入平皿内，使培养基均匀扩散。琼脂平面应光滑，不发生气泡。在室温内静置1～2h后应用。

（2）在接种菌液前，应当全部吸出培养基管内的液体

（3）在加血清过程中一定不要把血清滴在培养基面上。

（4）在每批试验时均需加标准液测定管为对照，以资比较。

七、体液内卡那霉素浓度的测定

1．原理 卡那霉素不溶解于乙醇，而溶解于水。在室温无菌情况下，pH 2～11时相当稳定。在pH 6～8加热煮沸时，其活力可维持30min。常用者为其硫酸盐，呈白色结晶性粉末状。卡那霉素硫酸盐水溶液在120℃高压蒸汽灭菌1h，其耗损量不超过10%。

卡那霉素肌内注射后，吸收迅速，在肌内注射1h血液内浓度达到最高峰。不同剂量血液内的浓度也不相同。如肌内注射卡那霉素0．25g时，1h的血液浓度为5～22μg／ml，平均值为10μg／ml；肌内注射0．5g时，1h的血液浓度为19～50μg／ml，平均值为25μg／ml；肌内注射1g时，1h的血液内浓度为9～54μg／ml，平均值为30μg／ml。而在24h的血液内卡那霉素浓度，肌内注射0．25g时为0；肌内注射0．5g时血液内浓度为0．75μg／ml；而肌注1g时为1μg／ml。

肌内注射卡那霉素后，胸腔积液、腹水内的药物浓度比较高，而胆汁（一般约为血液浓度的1／4）与粪便（50μg／g）内的浓度比较低。由此可见，卡那霉素的肝胆循环很少。卡那霉素很少渗入唾液、支气管分泌物或无炎症性变化的脑脊液中。当按7．5mg／kg剂量一次肌内注射后，脑脊液内的含药浓度约为血液浓度的1／10～1／5，其药物的高峰浓度在肌内注射后3～5h出现。在脑脊液发生炎变时，其中药物浓度可比正常人高一倍左右。

卡那霉素口服后不易吸收。肌内注射卡那霉素后15～30min即可测出血液内药物浓度，血液内药物浓度在1～2h可以达到高峰。一次肌内注射卡那霉素1g后的高峰浓度可达30μg／ml以上，6h后血液浓度在5～15μg／ml以上，12h下降至1～2μg／ml，在24h后即测不出药物含量。肌内注射0．5g时血液平均高峰浓度为20μg／ml，肌内注射0．25g时血液高峰浓度为10～15μg／ml。

2．材料

（1）培养基：pH 7．8琼脂培养基，见链霉素体液内浓度测定。

（2）菌液制备：挑选对卡那霉素敏感的金黄色溶血性葡萄球菌，常用者为金黄色溶血性葡萄球菌209P株。制备方法，见利福平体液内浓度测定法。

（3）试验用琼脂平皿：取上述pH 7．8琼脂培养基，加热溶解后，取10ml加入平皿内，为底层。另取此溶解琼脂培养基100ml，放入55℃水浴内，待培养基冷至50℃左右，加入菌液1ml，充分混匀。取此含菌培养基5ml，加入上述平皿内底层培养基之上，迅速散开，为上层或菌层。凝固后，即实验用琼脂平皿。或于底层培养基上，直接加入1∶5稀释的菌液2ml，均匀散布在培养基面上。吸去多余菌液，为实验用琼脂平皿。其余方法按小杯法放入钢杯。

3．方法

（1）标准曲线绘制：取卡那霉素注射液，每个安瓿含量0．5g／2ml。用pH7．4磷酸盐缓冲液稀释，最后用血清稀释至1μg／ml、5μg／ml、10μg／ml、20μg／ml、30μg／ml、40μg／ml、50μg／ml。取实验用琼脂平皿，每个平皿内放6个小杯。取标准液依次加入小杯内，每一小杯加入标准液5～6滴至杯口。加完测定液后，平放于37℃温箱内，培养16～18h，测定抑菌圈直径，绘制标准液曲线图。编制标准液含量表，供临床试验用。

（2）临床试验：于早晨取卡那霉素硫酸盐注射液0．5g，肌内注射后，于不同时间采取静脉血液。在无菌操作下分离血清放入灭菌试管内。用灭菌毛细吸管吸取血清，加入试验用琼脂培养基平皿内小杯中，每个小杯内加5～6滴血清至杯口，每一平皿内应有标准液为对照。加完测定样品后，平放于37℃温箱内，培养16～18h，取出观察试验结果。测定抑菌圈直径。从标准液含量表中求出血清内卡那霉素含量。

4．注意事项 小杯间距离应相等或根据测定标本浓度高低调整。