自Robertkoch发现结核病的病原体为MTB以来,随着分枝杆菌生理,生化研究的不断深入,新的生化、免疫及分子生物学实验方法的出现,为结核病的实验室诊断提供了更为快速、准确、敏感的方法,尤其是对肺结核的诊断更为突出。下面就细菌学、免疫学和分子生物学诊断肺结核介绍如下。
一、细菌学诊断
细菌学诊断包括直接厚涂片,浓缩集菌、分枝杆菌培养及鉴定。
涂片抗酸染色一直是检查AFB的首选方法。由于阳性涂片时痰液中菌量必须多于1× 104/ml,其阳性率与患者排菌量明显相关,故为提高阳性率,现多采用厚涂片法。浓缩集菌法虽较常规涂片阳性率高,与厚涂片法相比,但方法相对繁琐,故现临床应用不多。若用沉淀集菌,由于与离心速度明显相关,即离心力越大,阳性率越高。涂片后抗酸染色,主要是Ziehl-Neelsen染色和冷染色法。目前,荧光显微镜检查AFB阳性率较Ziehl-Neelsen法高,加上改金胺O为吖啶橙,无致癌可能,将使荧光显微镜检查AFB日益普及。分枝杆菌培养在结核病诊断方面具有决定性意义。近50年来,由于化疗的广泛应用,MTB的营养代谢发生了明显的改变,SPCN也日益增多,特别是耐INH菌株的出现和L型细菌的发现。在细菌学诊断上对培养基的组成要求更高。改良L-J培养基是目前最广泛用于分枝杆菌分离培养及耐药性测定的培养基,鸟分枝杆菌则受抑制。培养基中以0.3%丙酮酸钠代替甘油,并加入0.25%葡萄糖,对牛型结核分枝杆菌及耐INH菌株有促进生长作用。1984年,有人发现加去垢剂后的Dubos培养基,能使分枝杆菌呈均匀状生长。最常用的去垢剂是患者80。患者80能自然水解,使油酸盐释入培养基刺激分枝杆菌呈均匀状生长,但油酸盐过多亦可导致抑制生长,故在制备培养基时,应加入牛血清白蛋白以结合过量的油酸盐。现用于MTB研究的大多数培养基都是以Dubos配方为基础。Middlebrook-Cohn7H-10琼脂培养基内含生物素、触酶、吡哆醇,能刺激临床标本中“受损”的MTB复苏,其生长速度较改良L-J培养基提前1周,延长培养时间2周,其阳性率与改良L-J培养基相似。1968年Cohn在7H-10培养基中加入0.1%酪蛋白水解物制成7H-11培养基,1981年Jagues等又在7H-11培养基内加入5μg/ml硒酸钠制成改良7H-11培养基培养MTB,3~5d即可长出菌落。Middlebrook等以14 C标记的7H-12液体培养基中软脂酸底物,采用放射免疫技术测定亦明显缩短了培养时间。迄今,人们已研究发现酶Q、维生素K、维生素E、维生素B12、细胞色素C、核酸等可促进MTB生长。20世纪80年代,建立了放射性核素检测分枝杆菌,进行分枝杆菌药敏试验及菌型鉴定,使用仪器主要是BACTEC-TB460检测仪,它不仅敏感而且速度快,培养加药实验只需20d。
BACTEC-TB460作为一种标准化的培养系统,能促进分枝杆菌生长,并对其他细胞生长有抑制作用,使培养时间明显缩短3~4周。Middlebrook等在BACTEC-TB460培养系统中加入14C标记的棕榈酸,该底物的代谢为分枝杆菌所特有,分枝杆菌即通过代谢将其转化并产生14CO2。通过放射性测定法测定14CO2生成量,即可判断有无分枝杆菌生长。结果表明,采用该技术仅需几天即可明确判断有无细菌生长,后经进一步改进,目前平均仅需9d即可判断结果。但由于有放射性污染,临床应用将逐渐减少,而被BACTEC-MGIT和960系统取代。两者在检出时间、阳性率相当,但污染率稍高。
Siddiqi等将该技术用于分枝杆菌菌型鉴定,结合测定生长速率(分枝杆菌生长速度较慢,部分MOTT生长速率较快)、烟酸实验(MTB阳性,多数MOTT阴性)和NAP实验(NAP可抑制MTC生长,但不能抑制MOTT生长),平均2~6d即可鉴定出结果。Siddiqi等对100份标本用双盲法进行鉴定,与细菌生化反应等鉴定方法相比,结果全部正确。Firedman等将BACTEC-TB460快速培养技术与ELISA法结合,仅需13d即可得出培养结果,有效地鉴别MTC和MOTT,该方法敏感性高。笔者曾在12B培养基中直接以PCR鉴定MTB,取得了满意的效果;同时,将TCH加入12B中,也可直接鉴定MTB和牛型结核分枝杆菌。若能将BACTEC-TB系统快速培养系统与分子生物学技术(DNA探针、PCR技术等)相结合,将进一步提高实验室诊断水平。近年来,分枝杆菌快速变色液体培养基由于不需要特殊仪器,在检出时间、阳性率与BACTEC-MGIT和960系统相当,经多家实验室验证,涂片阳性的结核分枝杆菌检出时间为2~10d,平均7d,涂片阴性的结核分枝杆菌检出时间为10~25d,平均18d,且污染率低,已越来越受到人们的青睐。
HPLC技术用于结核病的诊断及分枝杆菌菌型鉴定,同样具有快速、敏感和特异性高等优点,但由于裂解气相色谱仪价格昂贵,难于在一般临床实验室广泛应用。
二、分子生物学诊断
分子生物学诊断肺结核常用DNA探针技术和PCR技术等。现已有商业化的探针销售。
DNA探针已被广泛应用于分枝杆菌的分类与鉴定,也可用于临床标本的检查,即将痰或组织标本置于适当的表面固定,加上已标记的特异性DNA探针,经洗掉多余的探针,则可见到标记。此即原位杂交。国内外均有DNA探针用于结核病的诊断,但迄今为止,DNA探针直接检测痰标本敏感度不十分理想。
分枝杆菌质粒检测可判断分枝杆菌的存在,许多分枝杆菌有质粒,能自主复制,经SDSPAGE处理未经降解的细菌DNA,便可以测出质粒。分枝杆菌噬菌体检测也可用于分枝杆菌的鉴定与分型。但MTB尚未发现质粒。
PCR技术于1989年由Hance等最先用于诊断肺结核,它具有快速、敏感和特异性高三大特点,且试验程序简单,是当今结核病实验室诊断最有发展前途的试验。目前正在完善,定量PCR技术进入临床应用阶段,特别是荧光定量PCR仪的问世,PCR技术的自动化程度明显提高,污染机会减少。近年来,PCR检测血液中多形核白细胞中MTB-DNA的研究日益增多,因其阳性率高于分枝杆菌培养。
耐药性基因的检测,包括基因芯片技术在不久的将来可能会用于临床。
Brisson-Noel等用DNA-PCR技术对分枝杆菌65kDa抗原的DNA片段进行扩增后,用特异性DNA探针进行杂交鉴定,共检测35份临床标本,结果传统方法培养阳性者该方法均为阳性,而有2例确诊为结核病者经INH、RFP和EMB联合化疗1个月后,传统方法培养阴性。到目前为止,PCR技术用于分枝杆菌检测,其灵敏度可达1fg DNA(相当于1个菌体DNA),所需检测时间仅1~2d,明显优于传统培养方法及鉴定方法,且可检出用药后不易培养的细菌。
分枝杆菌DNA指纹技术的应用,将可能阐明结核病内源性复发和再感染的机制。
三、免疫学诊断
肺结核的免疫学诊断包括体液免疫和细胞免疫两个部分,尽管目前尚未证实分枝杆菌特异性抗体对机体具有保护性作用(结核分枝杆菌为胞内寄生菌),但许多研究证明,肺结核患者体液免疫呈有规律变化,如活动性肺结核患者血清中IgG、IgA、IgM和IgE含量均不同程度升高,而以IgG和IgA含量升高尤为明显,其升高程度与病变活动程度成正比,随病情的好转,Ig含量亦恢复正常,粟粒性结核更为明显。总之,肺结核患者免疫反应状态为粟粒性结核或严重活动性结核T细胞水平降低,细胞免疫反应低下,B细胞水平增高,即体液免疫反应——特异性抗体水平明显升高,并随化疗的进行和临床改善而恢复正常,其细胞免疫和体液免疫颇似连续光谱现象。因此,通过对肺结核患者血清中特异性抗体的检测,可鉴别诊断活动性肺结核与非活动性肺结核及肺部其他疾病,并可随访肺结核的化疗效果及监测BCG免疫效果。
现用于结核的特异性抗体检测的方法有胶体金标记技术、直接凝集试验,双相免疫扩散,对流免疫电泳、被动血凝试验、RIA、ELISA和ABC-ELISA等检测特异性IgG,以后两种方法应用最为普遍。由于各个实验室使用的抗原不同,检测方法不同,检测特异性IgG的阳性率为76%~94%,特异性为78.6%~100%。因此,ELISA法检测肺结核病患者血清中特异性IgG还有待于进一步比较研究,使其标准化,提高其敏感性和特异性。尤其是特异性免疫复合物含量的检测,看是否与抗体、抗原检测有一定关系。
结核菌素皮肤实验(OT或PPD)至今仍然是肺结核诊断常用的三种检查方法之一(X线检查、痰菌和结核菌素实验),由于其操作简便,对婴幼儿和儿童肺结核有一定诊断价值。对成人肺结核有一定的辅助诊断价值,故它亦是肺结核诊断的过筛试验。
肺结核的诊断常常需要与肺癌作鉴别诊断,尤其是痰菌阴性的肺结核与痰癌细胞阴性的肺癌鉴别诊断,TSA和ADA可作其鉴别诊断指标。前者ADA活性升高,TSA含量90%以上的TSA含量升高,经抗结核治疗无变化,且ADA活性正常。至于血清IL-2R、γ-IFN和 TFN含量检测不能用作肺结核与肺癌的鉴别诊断,因两者上述3项指标均呈相似变化,即免疫功能降低,3项指标均呈不同程度升高。此外,血清癌胚抗原(carcinoem-brgonicantigen,CEA)可作为两者的鉴别诊断,各种类型的肺癌患者血清CEA阳性(>5ng/ml)可达60%~70%,而肺结核患者血清CEA多为阴性(<5ng/ml)。一些细胞因子和白细胞分化抗原的检测也可用于结核病的辅助诊断指标。
总之,结核病的实验室检查对结核病的诊断、治疗和预后等均有极其重要的意义。肺结核患者痰涂片特异性较高(>95%),但敏感性低(一般为10%~20%),儿童因痰标本不易获得,痰涂片阳性率仅为5%,且不能鉴别MOTT。痰培养的特异性较高。敏感性也只有40%左右,近年来,由于MTB的耐药菌株及MOTT感染率增高,临床上对药敏试验和菌型鉴定要求尤为必要,而传统方法则至少需要6周。经人们大量研究,现已开展了快速培养、分子生物学技术和实验免疫技术等,但仍不十分完善,许多问题尚待进一步研究解决,各种先进的检测方法尚待标准化,相信不久的将来,这些方法将会更加完善而被广泛用于结核病的临床诊断。
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