实验室方法在结核性脑膜炎诊断中的临床应用

结核性脑膜炎是严重威胁人类健康的重症结核病之一，也是发展中国家较为常见的疾病，常因诊断和治疗不及时而危及生命。由于结核性脑膜炎早期的症状、体征、CSF常规和生化指标改变不典型，CSF中MTB检出率不高造成诊断困难，从而延误了及时诊断与治疗，影响了预后。因此，提高结核性脑膜炎的诊断水平仍是众多学者所关注的课题。近20年来，随着细菌学、生物化学、免疫学和分子生物学技术的不断发展和应用，结核性脑膜炎的实验诊断取得了很大进展，改变了既往主要靠CSF中AFB和分枝杆菌培养的单一局面。下面就常用的结核性脑膜炎实验室诊断方法及其临床意义介绍如下。

一、生物化学诊断

虽然结核性脑膜炎的CSF的常规与生化改变约有1／3不典型，但CSF检查对结核性脑膜炎的诊断具有极为重要的价值。CSF中找到结核菌，虽然不多，却是结核性脑膜炎的确诊依据，CSF各项检查均在正常范围时，基本上可以除外结核性脑膜炎的诊断。除结核菌外，其他各项检查对结核性脑膜炎的诊断都无特异性，但结合临床表现，CSF中各项检查的变化，综合分析，CSF检查对结核性脑膜炎的早期诊断，却有很重要的意义。浅野秀二观察11例儿童粟粒结核，每周腰穿1次，结果发现无脑膜炎症状时，CSF即有典型的结核性脑膜炎改变。童氏报道急性粟粒型结核在出现脑征前，CSF各项检查均有异常，提出急性粟粒型结核，应进行CSF常规检查。说明病理改变在先，临床症状后出现。笔者也认为，凡是血行结核患者，无论有无脑膜刺激的症状与体征，应将腰穿列为常规检查，至少2次以上。对可疑结核性脑膜炎的患者，腰穿应列为首选的检查且要反复进行，这样，对不少的结核性脑膜炎可以做到早期诊断。

（一）一般检查

1．压力 结核性脑膜炎半数以上压力增高，一般在200～400mmHg（1．8～－3．6kPa）。应除外精神紧张、憋气、咳嗽、胸腹腔压力增高、腰穿时下肢弯曲过度挤压腹部等因素，均可使脑压升高。另外，腰穿前频繁呕吐、液体入量过少、应用脱水药、椎管梗阻，结核性脑膜炎时脉络丛变性、萎缩、上皮细胞分泌CSF功能丧失即原发低颅压等，可表现颅压降低，可降至60～ 0mmHg（0．54～0kPa）。

2．外观 多为无色透明，蛋白增高明显则呈微浑浊的毛玻璃样或呈黄色，变态反应过高，血－脑屏障通透性增高时，可呈血性CSF。静置后可出现薄膜（纤维膜或蜘蛛膜），薄膜的形成不是结核性脑膜炎的特异性表现。

3．细胞 结核性脑膜炎的早期，细胞数正常，继续观察，细胞数逐渐增高。据统计正常细胞占4%，300×106以内占78%，300×106以上占18%，少数患者可多达（1 000～15 000）× 106，大多数在（30～500）×106／L，结核性脑膜炎的极早期，为非特异性炎症阶段，细胞分类以中性分叶核为多，随病程延长，演变为单核细胞为主。细胞数的恢复经常迟于糖与氯化物，因此，细胞数不但是诊断的重要依据，也是判断治疗效果与预后的指标。

4．蛋白 潘氏实验可以粗略了解球蛋白是否增高，蛋白定量的诊断意义更大，CSF中蛋白量结核性脑膜炎时多数在1～3g／L，蛋白持续上升，则是走向慢性过程的趋势，椎管梗阻时，蛋白可升高达20g或以上，并可出现蛋白细胞分离现象，蛋白显著升高，而细胞增加的不多。

5．糖 正常人CSF中的糖量约为空腹血糖量的1／2，结核性脑膜炎有60%以上患者血糖低于正常，29%患者血糖量正常。结核性脑膜炎患者合并糖尿病或输注葡萄糖时，CSF中糖升高，不进饮食，呕吐，CSF在空气中暴露时间过长，葡萄糖分解时，均可使CSF中糖量降低，判断时应注意除外这些影响因素。1／3左右的结核性脑膜炎糖与氯化物同时双项降低，对结核性脑膜炎的诊断比糖或氯化物单项降氏的意义更大，早期病例，两者均可正常，对可疑结核性脑膜炎的病例，应当复查CSF，方能作出正确判断。

6．氯化物 正常人CSF中的氯化物（120～130mmol／L）较血清中氯化物（100～106mmol／L）高，机制不明，CSF中的氯化物随血中氯化物的变化而变化，当CSF中蛋白升高时，氯化物就减少，多数结核性脑膜炎患者呈低氯血症，CSF中氯化物也降低，氯化物同时伴有血糖降低，对结核性脑膜炎才有诊断意义。

（二）生化指标检查

CSF生化指标检查虽不能确诊结核性脑膜炎，但可作为结核性脑膜炎与其他脑膜炎鉴别诊断的辅助方法。有关结核性脑膜炎的生化指标检查方法很多，除以上常用的糖、蛋白、氯化物含量检测，还包括多种酶活性的检测。其中，以ADA和MTB硬脂酸的应用研究进展较快。

1．腺苷脱氨酶测定 腺苷脱氨酶测定（ADA）是核酸代谢中的重要酶类，广泛分布于人体各种组织及细胞中，以红细胞及T细胞含量最高。ADA与T细胞的增殖、分化有密切相关。Piras等首先报道CSF中ADA活性正常参考值上限为6～8U／L，并发现结核性脑膜炎患者CSF中ADA活性显著高于可疑结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎患者和正常人，对结核性脑膜炎诊断阳性率为96%。Malan等观察了29例结核性脑膜炎、13例其他细菌性脑膜炎，其ADA活性分别为（15．7±22．1U／L）及（9．1±10．1）U／L，两组有显著差别。Coovadia等的检测结果表明，如以＞10U／L为判定标准，则38例儿童结核性脑膜炎，阳性率为73%。Ribera等观察了大量对照患者CSF中的ADA，结果仅有2例假阳性，而结核性脑膜炎患者CSF的ADA检测特异性达99．4%。但Mann等报道假阳性率高达16%。最近，国内学者高薇薇等观察了ADA等多项指标对早期结核性脑膜炎的诊断价值，结果表明ADA和核酸扩增对结核性脑膜炎早期诊断有意义，在所检测的52例临床确诊为结核性脑膜炎患者，CSF的ADA阳性23例，阳性率52．3%，但与国外报道有一定差距。总之，CSF的ADA检测对结核性脑膜炎的诊断有一定价值，尽管结核性脑膜炎与细菌性脑膜炎CSF中ADA活性有重叠，但由于ADA检测操作简便，不需特殊仪器设备，适用于一般实验室用于结核性脑膜炎的辅助诊断。

2．MTB硬脂酸测定 MTB硬脂酸（TSA）是菌体结构中特有成分，其化学结构为10－甲基十八烷酸，首先由Anderson和Charpaff从MTB中分离出来。Brooks等首先采用气相色谱技术检测了12例结核性脑膜炎患者CSF中的TSA，结果全部阳性。Trench等的研究表明87例非结核性脑膜炎患者，包括化脓性脑膜炎、病毒性脑膜炎和非传染性疾病患者CSF的TSA检测结果全部阴性；而22例结核性脑膜炎患者中21例TSA阳性。该学者同时比较了TSA和CSF中MTB检查结果，22例TSA均为阳性的结核性脑膜炎患者CSF培养及涂片仅有8例阳性。此后，Canadis等对35例结核性脑膜炎、19例非结核性脑膜炎患者CSF进行TSA检测，结果MTB和35例结核性脑膜炎患者CSF中TSA全部阳性，而非结核性脑膜炎患者CSF及其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌等TSA均为阴性。国内学者研究表明，结核性脑膜炎患者CSF的TSA检测阳性率为74．6%～100%。经过系统观察，其检出TSA阳性的持续时间最长达11个月，并可间断出现阳性。此结果与国外报道可持续阳性达9个月，并可间断出现阳性的结果一致。刘雪平等的研究结果表明，43例结核性脑膜炎患者TSA全部阳性，而40例非结核性脑膜炎患者均为阴性。虽然TSA检测对结核性脑膜炎诊断的阳性率较培养法、涂片法高，但亦存在假阳性问题。其原因与色谱柱老化等因素有关。此外，也有少数临床确诊的结核性脑膜炎患者CSF的TSA检测为阴性。因此，TSA对结核性脑膜炎的诊断价值尚待进一步研究。但多数学者认为该项技术诊断结核性脑膜炎灵敏、特异，值得常规开展，只是所需仪器价格太贵。

（三）其他生化检查

结核性脑膜炎患者CSF荧光素钠实验、色氨酸测定、溴化物或放射性溴化物分离实验、β2微球蛋白、铜蓝蛋白、溶菌酶等的测定也有报道，它们对结核性脑膜炎的诊断和鉴别诊断，对疗效及预后判断等均有一定的参考价值。

1．荧光素钠实验 荧光素钠实验（floure sceinsadium test，FST）曾用于结核性脑膜炎的早期诊断，20世纪60年代曾认为对诊断结核性脑膜炎的特异性不高，临床上未能推广应用。王氏于1981年以后研究认为FST诊断结核性脑膜炎的阳性标准改为≥6×107，诊断结核性脑膜炎的特异性可提高到94．6%，且发现CSF中的荧光素钠（FS）和氯（Cl－）浓度呈负相关（P＜0．025），这一负相关现象优于CSF中糖与氯双项下降的指标（P＜0．001），推荐FST可用作结核性脑膜炎的早期诊断。早在1956年，中华结核病科杂志就刊登了“结核性脑膜炎问题座谈会综合报告”文章中提到，FST在结核性脑膜炎患者症状出现前1～2个月即呈阳性，且阳性率为100%，是结核性脑膜炎早期诊断的好方法。1988年中国防痨通讯报道“全国结核性脑膜炎诊断技术进展学术座谈会总结”，认为FST的阳性率为93．1%～98．0%，特异性高，方法简单，对结核性脑膜炎的早期诊断、鉴别诊断有一定的意义。

2．色氨酸测定 黑龙江省结核病防治研究院，CSF中色氨酸量测定120例结核性脑膜炎中，102例阳性，阳性率85%，各种非结核性脑膜炎45例中，3例阳性，阳性率仅6．7%。有学者认为未用链霉素治疗的阳性率可达93%～100%，经过链霉素治疗的阳性率则降为64%，该实验对结核性脑膜炎的早期诊断有参考价值。

3．溴化物或放射性溴化物分离试验 溴分离试验（bromide partition test，BPT），系口服或静脉注射溴化物或放射性溴化物后，24～48h同时测血清与CSF中溴化物含量，以观察血脑屏障的通透性，Taylor发现血清／CSF溴化物比值＜1．6时支持结核的诊断，Wiggelinkhui－zen用82Br做分离实验，在确诊结核性脑膜炎的51例患者中，血清／CSF82 Br比值＜1．6者48例；非结核32例中，比值＜1．6者仅3例。认为敏感性与特异性均接近90%，1982年Mann与1986年Coovadia均证明其对结核性脑膜炎诊断的特异性优于CSF中ADA的测定，虽然该实验需要特殊设备，存在放射性核素损害，但对结核性脑膜炎的早期诊断具有较大的实用价值。

4．β2微球蛋白 有报道结核性脑膜炎20例的CSF中，有19例存在β2微球蛋白明显升高（占95%），正常值为2．46μg／ml，对结核性脑膜炎的诊断有一定价值。

5．铜蓝蛋白 国内外对肺结核血清铜蓝蛋白的研究报道较多，对结核性脑膜炎的CSF中铜蓝蛋白研究，仅见阎氏报告40例，认为急性、迁延性与慢性期结核性脑膜炎患者CSF中，铜蓝蛋白较正常人与非结核性脑膜炎患者明显升高，恢复期结核性脑膜炎与正常人相同，对结核性脑膜炎的早期诊断、鉴别诊断和观察病情有参考价值。

6．溶菌酶（LZM） LZM是一种存在于组织与体液中的非特异性杀菌物质，与抗体、补体、备解素、干扰素和吞噬细胞功能有协同作用，参与抗体非特异性防御（免疫）机制，是一种免疫物质，但在无菌的尿液、汗液与CSF中则无LZM存在。结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎CSF中LZM明显升高，病毒性脑膜炎则正常，LZM可作为结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎与病毒性脑膜炎的鉴别诊断指标。祖氏报道CSF中LZM含量与生化检查结果平行，但LZM含量测定较生化检验灵敏度高，动态观察发现，病情恶化，LZM逐渐升高；病情好转，LZM则逐渐下降，痊愈时LZM含量为零，认为LZM测定有助于结核性脑膜炎的诊断、鉴别诊断、疗效判定，可作为观察病情与结核性脑膜炎是否治愈的一项免疫学指标。结核性脑膜炎的CSF中LZM含量最高，化脓性脑膜炎的CSF中LZM含量较高，两者之间有非常显著差异（P＜0．01），但两者有部分重叠，用LZM的绝对值来鉴别两病要受到很大限制，该学者提出结核性脑膜炎CSF中的LZM主要来自单核巨噬细胞，化脓性脑膜炎主要来自中性粒细胞，总结18例结核性脑膜炎溶菌酶指数平均为559．85，26例化脓性脑膜炎溶菌酶指数平均为3．31，可见结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎溶菌酶指数有明显差别。CSF中LZM活性测定和结合LZM指数是鉴别结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎有价值的指标。

7．气体分析 磨氏对56例结核性脑膜炎的CSF进行气体分析，活动性结核性脑膜炎与活动性结核性脑膜炎合并高颅压患者，CSF的pH升高，PO2降低，PCO2变化不明显，CSF的气体分析无特异性，对结核性脑膜炎的诊断意义不大，只能作为观察了解病情的参考。

8．微量元素测定 董氏报道结核性脑膜炎CSF中镁、锌、铁降低，铜升高，化脓性脑膜炎和病毒性脑膜炎则镁升高，故镁的测定，可作为结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎及病毒性脑膜炎的鉴别参考。

二、细菌学诊断

结核性脑膜炎的细菌学诊断主要通过CSF涂片检查AFB和分枝杆菌培养检查来确定诊断。但涂片检查AFB和培养分枝杆菌的阳性率均较低。

CSF中结核菌检查是早期确诊的最重要方法，但国内CSF中结核菌的检出率普遍很低，涂片法阳性率15%～30%，培养阳性率为30%～40%，孙氏报道CSF阳性率漂浮浓集法为92．9%，离心浓集法为62．5%，直接涂片法仅10．7%。颜氏报道离心沉淀阳性率为21．4%，滤膜法为42．8%。国外报道检出率差别很大，主要取决于CSF标本的仔细检查时间、标本的量与检查次数。检查CSF静置后形成的薄膜，可以提高细菌检出率，Stewar报道100例结核性脑膜炎中91例中91%找到细菌，其采用的方法是CSF 10～20ml，经每分钟2500转，离心30min，取薄膜制作厚涂片，镜检30～90min，Hlingworth对144例结核性脑膜炎用同样方法检查，85%找到细菌，而其他研究者不用这种方法检查，细菌阳性率仅有10%～40%。另据报道，CSF中AFB检出率的高低与标本的离心速度和时间密切相关。Krambovitis等的研究表明，CSF高速离心后取沉渣涂片检查AFB，阳性率可达83．3%。这充分说明了CSF高速离心检查AFB的价值。其原因是AFB平均相对密度为1．014，而结核性脑膜炎患者CSF为渗出液，其相对密度较高，故传统的离心法不能将AFB沉淀下去，以致CSF涂片检查AFB或培养检查分枝杆菌为阴性。如用普通离心机，则至少采用每分钟3000转，离心30min。

Smith等也认为从新鲜的蛛网膜里约有90%可以查到结核菌。有一组研究报道52例结核性脑膜炎患者中，45例的CSF多次涂片找到抗酸杆菌（AFB），阳性率为87%，培养阳性率83%，首次标本阳性19例，阳性率37%；第二次标本阳性13例，阳性率25%；第三次标本阳性10例，阳性率19%；第四次标本阳性3例，阳性率6%。虽然检查次数增加，阳性率下降，要提高总阳性率，必须增加标本的检查次数，连续多次检查也可提高CSF中AFB检出率。这充分说明CSF连续多次细菌学检查的重要性。但检查时间延长，不能达到早期诊断的目的。因此，如何提高CSF中AFB或分枝杆菌检出率仍是亟待解决的问题。

结核菌L型引起的结核性脑膜炎，其患者CSF中结核菌分离培养阳性率都很低，影响阳性率的因素很多，其中结核菌变异为结核菌L型，起了重要作用。笔者在文献报道中曾提到，结核菌L型与结核菌有许多不同之处，包括结核菌L型具有可塑性与滤过性。与结核菌不同的是，其可以透过各种生物膜与血－脑屏障，进入血液和CSF中。血行结核病时，多数是结核菌L型进入血液，血行结核病时血培养结核菌很少是阳性，血培养结核菌L型则常常为阳性，结核性脑膜炎患者若CSF中用涂片或培养法查不出结核菌时，CSF培养结核菌L型可以阳性。庄氏报道53例结核性脑膜炎患者的CSF培养结核菌阳性1例，阳性率1．8%；培养结核菌L型阳性9例，阳性率17．0%。结核菌L型的培养时间仅为结核菌的1／8～1／6周，CSF培养结核菌L型不但可以确定诊断而且可以早期诊断结核性脑膜炎。

近年来，随着BACTEC－TB460或960系统等检测系统在CSF中培养MTB的应用，明显提高了结核性脑膜炎患者CSF细菌学检查的阳性率，并使培养时间显著缩短。但上述仪器设备和试剂价格昂贵，限制了其在结核性脑膜炎诊断中的应用。可喜的是近年来快速变色液体培养基的研制与开发成功，其对结核性脑膜炎的细菌学快速诊断必将起到巨大的推动作用。

有关结核性脑膜炎患者CSF的L型检查也有不少报道。庄玉辉等的研究表明53例结核性脑膜炎患者经抗结核药物治疗1～2个月后采CSF检查。有9例分离出L型MTB，阳性率17%，与Mattman报道相似。笔者发现结核性脑膜炎患者CSF在他们自制的TSA－L培养基上培养1个月，形成幼小的L型菌落，由十几个或几十个小球体组成。估计CSF含100～400／ml个L型MTB。如将带有L型MTB菌落的琼脂块切下，涂抹于改良L－J培养基斜面上，37℃培养14d，可见灰白色，光滑型菌落，于21d挑菌落涂片行抗酸染色，呈抗酸性短杆菌。另据白淑敏报道，从50侧结核性脑膜炎患者CSF中分离出4株L型MTB，阳性率8%。研究表明CSF培养MTB的阳性率极低而且培养时间长，而L型MTB的培养时间短于MTB培养，且阳性检出率高于MTB检出率。这可能与多数结核性脑膜炎患者在采样培养时，都已接受抗结核治疗，CSF内的抗结核药物对培养MTB产生抑制作用，而药物对L型MTB菌而言恰与诱导剂有关。由此可见，开展L型MTB的研究与检测，是十分必要的。

三、免疫学诊断

尽管CSF细菌学检查是确定诊断结核性脑膜炎的金标准，但是由于CSF涂片检查AFB和培养分枝杆菌阳性率偏低，因此结核性脑膜炎的免疫学诊断具有重要价值。回顾100多年的研究历史，结核性脑膜炎的免疫学诊断尽管取得了很大成绩，但还是存在一些问题。下面就目前较为常用的一些免疫学诊断方法及其临床意义叙述如下。

（一）脑脊液免疫球蛋白检测

正常人CSF中免疫球蛋白含量较低，主要为IgG和少量IgA，用一般方法不能测出。当中枢神经系统感染时，CSF免疫球蛋白含量可有不同程度的升高。Ner Emberg等的研究表明，结核性脑膜炎患者CSF中IgG、IgA和IgM三种免疫球蛋白显著升高，尤以IgG升高为主，化脓性脑膜炎IgG和IgM同时升高，但以IgM升高显著，而IgA基本正常，病毒性脑膜炎免疫球蛋白含量基本正常。国内胡忠义等追试结果基本与国外报道相同，动态观测结果表明随着治疗天数的延长和临床症状的改善，CSF中升高的IgG含量逐渐下降。王相辅等的研究还表明，在治疗中结核性脑膜炎患者CSF的IgG值反应敏感，且在临床症状变化之前即发生改变，重症患者尤为明显。笔者认为CSF中IgG＞144mg／L，IgM＞22．4mg／L可以排除病毒性脑膜炎，IgG增加，即使IgA、IgM正常也不能除外结核性脑膜炎。因此，CSF免疫球蛋白测定对结核性脑膜炎的诊断和鉴别诊断以及疗效考核等都有一定价值。有关结核性脑膜炎患者CSF免疫球蛋白升高的原因一般认为是由于血－脑脊液屏障通透性增高所致，但也有人发现结核性脑膜炎患者CSF中存在外周血不能检出的少克隆IgG带，且能被MTB抗原吸附，提示中枢神经系统受抗原刺激后局部能合成特异性抗体。

（二）脑脊液LZM含量测定

LZM是体液中正常的非特异性杀菌物质，体内许多组织和体液中都含有LZM，但无菌CSF中不含LZM。因此CSF中LZM含量测定有助于中枢神经系统感染的诊断。Klockars等的研究表明结核性脑膜炎和化脓性脑膜炎患者CSF中LZM含量明显升高，而病毒性脑膜炎患者则基本正常。因此该学者认为CSF中LZM含量测定有助于鉴别病毒性脑膜炎与结核性脑膜炎或化脓性脑膜炎。国内学者祖桂荣等追试结果表明，31例结核性脑膜炎患者CSF中LZM测定结果和生化检查结果基本是平行的，即LZM含量高者，CSF蛋白和细胞数也增加，但有2例结核性脑膜炎患者CSF生化指标正常而LZM含量轻度增高，经了解这2例为临床已治愈的结核性脑膜炎患者。由此可见，LZM含量测定比生化指标检测灵敏度高。该学者还对3例结核性脑膜炎患者CSF进行动态观察，结果表明LZM含量随病情恶化而升高，随病情好转而下降，痊愈者LZM含量为零。因此笔者认为，CSF中LZM含量测定不仅有助于结核性脑膜炎的诊断，尚可为疗效判定及治愈与否提供依据。

（三）T细胞亚群测定

MTB属于细胞内寄生菌，因此人体的抗结核免疫主要是细胞免疫。大量的研究结果表明，结核性脑膜炎患者存在着明显的细胞免疫功能异常。主要表现为T细胞数量明显增高，且T细胞亚群比例失调。周善仁等的研究表明结核性脑膜炎患者CSF中的T细胞数（82．9%±1．1%）明显高于乙型脑膜炎（50．2%±1．5%），化脓性脑膜炎（69．5%±2．3%）和正常对照组（77．2%±1．3%），并发现结核性脑膜炎患者CSF中T细胞数明显高于自身外周血（60．7%±1．5%），提示结核性脑膜炎患者中枢神经系统内有局限性的T细胞介导免疫反应。张劭夫等的结果表明，结核性脑膜炎患者CSF中T3和T4细胞数分别为（70．5±11．2）%和（5．21±12．7）%，较自身外周中的T3和T4细胞数血明显增高，但T8细胞数在CSF和外周血中无差别。即结核性脑膜炎患者CSF中T细胞数增加及T4／T8比值增大，主要是T4细胞数增加。经抗结核治疗1个月后，CSF与外周血T4细胞数均较治疗前增加，外周血中T3细胞数也较治疗前增加。由此可知，结核性脑膜炎患者CSF中淋巴细胞亚群检测不仅有利于结核性脑膜炎的诊断，还可作为其治疗考核的指标。Kinnman等的研究结果证明结核性脑膜炎患者CSF淋巴细胞经PPD刺激后的转化率高于自身外周血T细胞。以上这些改变均提示CSF淋巴细胞亚群及转化实验的观察对中枢神经系统感染性疾病的鉴别诊断是有意义的。

（四）结核抗体测定

有关结核性脑膜炎患者CSF结核抗体的测定研究已有数十年历史。由于所用抗原和测定方法的不同，所得结果差异很大。但是，最近十几年的研究结果表明CSF结核抗体测定对结核性脑膜炎的诊断和鉴别诊断具有重要价值。

1983年，Kalish等首先报道ElISA检测CSF结核抗体，其以PPD为抗原，用ElISA法检测了3例结核性脑膜炎和33例对照患者血清及CSF中的抗PPD－IgG，结果3例结核性脑膜炎患者均为阳性，33例对照患者全部阴性。随后，Hernandez等以BCG为抗原，采用ELISA间接法检测了20例经细菌学确诊的结核性脑膜炎患者和70例对照患者CSF中的BCG－IgG抗体。结果结核性脑膜炎患者CSF中BCG抗体OD值为0．233～2．00，而对照患者在0．013～0．188，两者OD值差异有高度显著性（P＜0．001）。如OD值以≥0．20为阳性判定标准，则20例结核性脑膜炎全部阳性，而70例对照全部阴性。该学者还考核了方法的可重复性。通过对8例结核性脑膜炎和10例对照者CSF于不同实验日重复测定3次，结果变异系数均小于10%，证明本法重复性较好。Park等检测了27例细菌学证实的结核性脑膜炎患者，CSF结核抗体阳性23例（85%），而无菌性脑膜炎及其他神经系统疾病组78例中3例阳性，特异性96%。

我国胡忠义等报道33例结核性脑膜炎患者CSF抗PPD－IgG阳性30例，阳性率90．9%，而26例其他脑膜炎患者假阳性1例（3．8%）、110例非脑膜炎患者假阳性5例（4．5%）。随后马明和等报道，72例结核性脑膜炎患者CBF中抗Ag5的IgG抗体的阳性率为83．6%，而22例化脓性脑膜炎、9例病毒性脑膜炎、20例脑肿瘤、5例脑血栓及30例正常人等对照组中假阳性率为3．5%。还有研究表明结核抗体测定对儿童结核性脑膜炎的诊断具有重要价值。研究提示1岁以内儿童结核性脑膜炎组的阳性率为71．4%，1—5岁结核性脑膜炎组的阳性率为95．2%，5—14岁组的阳性率为96．2%，而75例对照仅有2例假阳性，假阳性率为2．7%。

为进一步提高CSF结核抗体的阳性检出率，有报道在ELISA技术中引入生物素－亲和素系统（biotin avidin system，BAS）。结果表明BAS检测40例结核性脑膜炎患者CSF结核抗体平均滴度为1∶177．5，而ELISA测定结果为1∶59．6，两法的滴度差异有高度显著性（P＜0．01），BAS较ELISA灵敏3倍左右，这将更有利于低抗体滴度患者的检出，减少漏诊。研究同时表明病后5d的CSF就可用BAS测出增高的特异性结核抗体，比ELISA提早1d以上。还有结果表明，BAS检测CSF抗PPD－IgG，阳性率达96．4%，而假阳性率仅为2．7%。BAS与ELISA平行实验显示，BAS的阳性检出率比ELISA提高10%以上，而两法特异性一致。因此检测CSF抗PPD－IgG作为结核性脑膜炎的辅助诊断方法，BAS优于ELISA。

还有研究表明，不同的结核抗原对结核性脑膜炎诊断的敏感性和特异性不同。Park等以PPD和脂阿拉伯糖（LAM）为抗原检测结核性脑膜炎患者CSF中特异性IgG抗体，结果分枝杆菌培养阳性和培养阴性结核性脑膜炎患者LAM抗体阳性率分别为90．9%和81．3%，而PPD阳性率仅为63．6%和56．3%，LAM抗原的阳性检出率明显高于PPD。Chabrramuki等以LAM和分子量为14kD、19kD、38kD及65kD等4种纯化抗原检测相应抗体，发现LAM和分子量为14kD抗原的抗体滴度升高最明显，阳性率均为53%，而26例化脓性脑膜炎、98例对照者无假阳性。国内闫世明等也探讨了结核杆菌38kD抗原、膜蛋白抗原以及PPD抗原对结核性脑膜炎的诊断价值。56例结核性脑膜炎患者CSF中3种结核抗原的诊断敏感性分别为51．8%、53．6%和55．4%；特异性分别为100%、100%和94．1%。笔者认为，38kD抗原和膜蛋白抗原因纯度较高，故检测的特异性较强，但敏感性较低；而PPD抗原纯度差，故检测的特异性偏低。薛承岩等也探索了CSF中LAM－IgG抗体测定对结核性脑膜炎的诊断价值。结果102份结核性脑膜炎患者CSF标本，LAM－IgG阳性52份，阳性率51．0%；而40份非结核性的中枢神经系统疾病患者的CSF标本均未检出LAM－IgG，特异性为100%。

除ELISA外，其他免疫学检测方法，如酶标抗原对流免疫电泳、胶乳凝集试验、固相间接血吸附试验、斑点免疫技术等均有用于诊断结核性脑膜炎的研究报道。据Krambo－vitis等报道，CSF胶乳凝集试验对结核性脑膜炎诊断也有重要价值。笔者采用纯化兔抗MTh胞膜抗原免疫球蛋白致敏胶乳颗粒，然后与待检CSF混合，观察是否凝集来协助诊断结核性脑膜炎。结果18例经临床或细菌学确诊的结核性脑膜炎患者，首次CSF检测阳性17例，1例阴性CSF经浓缩后再次检测也为阳性，因此本法最终阳性率100%；而134例其他疾病患者CSF只有1份假阳性，假阳性率0．7%。说明本法用于结核性脑膜炎的诊断不仅有很高的敏感性，而且还有较好的特异性。国内吴成翰等以纯化的OT致敏胶乳颗粒与CSF进行凝集试验，结果表明15例临床确诊的结核性脑膜炎本法阳性13例（86．7%），而60例非结核性脑膜炎患者假阳性2例（3．3%），95例其他脑疾病患者假阳性1例（1．1%），10例肺结核和30例健康人全部阴性。作者认为本法操作简便、快速，又有较高的敏感性和特异性，是结核性脑膜炎诊断中有前途的新方法，但需进一步证实。另外，彭万中等采用固相间接血吸附试验检测CSF结核特异性IgG和IgM抗体，结果表明40例结核性脑膜炎本法阳性28例，阳性率70．0%，显著高于ELISA间接法（36．1%）和ELISA捕获法（47．5%），但阳性率还是偏低。

在探讨CSF中IgG型结核抗体测定的同时，IgM型结核抗体的测定价值也引起了临床学者的高度重视。据报道CSF抗PPD－IgM于病后1周时已明显升高，2周左右达高峰，以后逐渐下降；而抗PPD－IgG则在病后2周起逐渐上升，并于6周时达高峰。因此IgM型结核抗体的测定对早期结核性脑膜炎的诊断价值大于IgG型结核抗体。而中晚期结核性脑膜炎，则IgG型抗体阳性率高于IgM型。如果同时检测两种类型的结核抗体，则本法对结核性脑膜炎的诊断敏感性可达97．8%，特异性为98．8%。

以上报道充分说明CSF结核抗体检测对结核性脑膜炎的诊断和鉴别诊断具有重要意义。但也有少数报道与上述结果不符。如Coovadia等对37例儿童结核性脑膜炎、43例其他脑膜炎和14例肺结核不伴有脑膜炎患者CSF中Ag5抗体进行检测，结果特异性为95．2%，但结核性脑膜炎组的阳性率不到30%。此结果可能与CSF过度稀释有关。因为多数报道CSF的最佳稀释度为1∶4～1∶10。

目前，CSF结核抗体检测存在的主要问题有以下几点。

1．存在着一定的假阳性和假阴性。综合多家报道，结核抗体检测的假阳性率在2%～15%，假阴性率在5%～70%。造成假阳性的原因主要与所用抗原的特异性有关，此外也与试剂质量及操作因素有关。假阴性原因除机体免疫因素外，还与试剂质量等因素有关。

2．结果判断带有主观性。目前多数测定方法采用肉眼观察法，根据显色深浅来判断结核抗体测定结果，因此带有主观性。

3．缺乏质控手段。结核抗体测定技术虽然发展很快，试剂反应板上也带有质控点，但只能对试剂质量进行质控，而无法质控检测结果的准确性。

4．试剂盒无国家检定标准以致试剂盒的质量不能保证，同时导致试剂市场的混乱。总之，CSF结核抗体测定研究已取得了长足进展，尽管在实际应用中还存在一些问题，但只要予以高度重视，不断加强研究，逐步加以解决，最终达到试剂盒的标准化、操作的规范化及临床意义的确定化，从而为我国的结核性脑膜炎实验室诊断提供可靠手段。

（五）结核抗原测定

在研究结核抗体测定的同时，人们也注意到了CSF结核抗原测定对结核性脑膜炎的诊断价值。1983年，Sada等首先以ELISA夹心法检测16例结核性脑膜炎患者CSF中的BCG抗原，结果平均OD值为（0．619±0．676），其中4例经细菌学证实的结核性脑膜炎患者OD值均在0．20以上，而12例疑似结核性脑膜炎患者中的9例OD值＞0．20，对照患者22例中除1例隐球菌性脑膜炎OD值＞0．20外，其余全部在0．20以下。如以对照组OD值均值加2个标准差为阳性判定标准，则本法阳性率为81．3%，特异性为95．0%。Eduardos等追试结果表明，本法检测CSF中MTB可溶性抗原的灵敏度为15ng／ml。在检测的38例结核性脑膜炎患者测得的抗原含量为（1．5±2．4）μg／ml，其中24例未经治疗患者含量为（1．8±2．9）μg／ml；另外14例已经抗结核治疗者为（0．37±0．54）μg／ml，两者的差异有高度显著性（P＜0．01）。如抗原值以≥0．25μg／ml为阳性标准，则24例未经治疗者阳性18例，阳性率75．0%，而14例已经抗结核治疗者阳性5例，阳性率35．7%，另外52例对照患者全部阴性。说明本法用于结核性脑膜炎的诊断具有一定敏感性和特异性，同时还可为疗效判定提供依据。

国内胡忠义等于1987年报道CSF结核抗原的测定结果。作者采用MTB单克隆抗体ELISA夹心法检测40例临床确诊的结核性脑膜炎、28例其他脑膜炎和59例非脑膜炎患者CSF结核抗原，结果3组的结核抗原平均OD值分别为（0．72±0．46）、（0．12±0．06）和（0．11 ±0．07）。如以对照组OD值均值加2个标准差为阳性判定标准，则40例结核性脑膜炎中的33例结核抗原阳性，阳性率82．5%；87例对照组中有1例假阳性，假阳性率1．1%，正确指数为81．35%，其中95%可性限为68．02%～94．68%。CSF结核抗原动态观察表明，随着治疗天数的增加和临床症状的改善，CSF特异性抗原水平逐渐下降。此外，笔者还比较了BASELISA检测CSF结核抗原的效果，结果本法敏感性为88．5%，特异性为96．6%，并且有13份CSF本法测定阳性，而夹心ELISA测定为阴性，说明BAS－ELISA测定技术可进一步提高CSF结核抗原阳性检出率。对发病不同天数的结核性脑膜炎患者CSF同时测定结核抗原和抗体，结果表明病程在10d内的CSF，结核抗原阳性检出率为86．5%，而结核抗体的阳性检出率为69．2%，两者的差异具有显著性，P＜0．05；而病程在10d以后的CSF，结核抗原的检出阳性率仅为41．3%，而结核抗体测定的阳性率为86．8%，两者的差异具有高度显著性，P＜0．01。该结果表明对于早期结核性脑膜炎患者应以CSF结核抗原检测为主，而以后随着结核抗体的产生及其含量的升高，结核抗体测定可获得较高的阳性率。

Bal等还采用竞争抑制性ELISA法，以经放射处理的MTB作为固相免疫吸附剂检测抗原，结果8例结核性脑膜炎患者均为阳性，33例非结核性脑膜炎组仅1例阳性。该例患者以后证实为葡萄球菌性小脓肿。其假阳性结果可能由于葡萄球菌A蛋白与酶标抗体结合所致。Chandramuki等报道反相被动血凝实验检测CSF结核抗原研究，结果25例MTB培养阳性的结核性脑膜炎患者中有22例阳性，64例可疑结核性脑膜炎患者中47例阳性，而115例其他脑膜炎及神经系统疾病患者中仅有5例假阳性。为了提高敏感性，Kadival等还建立了BAS放射免疫检测法。笔者用该法检测19例未经治疗的结核性脑膜炎患者和30例无菌性脑膜炎患者、26例其他神经系统疾病患者CSF。结果15例结核性脑膜炎患者结核抗原测定阳性，而30例无菌性脑膜炎患者及26例神经系统疾病对照患者均为阴性结果。最近，卢贤瑜等用3种抗原（BCG、聚合OT、BCG＋PPD）免疫家兔，获得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号抗血清，对67份CSF中结核抗原进行检测，结果Ⅲ号抗血清的阳性检出率为82%，特异性为100%。笔者认为Ⅲ号血清检测CSF结核抗原，有助于结核性脑膜炎的快速诊断。

（六）免疫复合物测定（IC）

有关肺结核患者血清特异性IC的测定及其临床意义已有不少报道。但CSF结核特异性IC的测定报道较少。据Gupta等的报道，CSF结核特异性IC的测定对结核性脑膜炎的诊断也有较高的阳性率。该作者采用ELISA测定了33例临床诊断的结核性脑膜炎患者和34例其他脑膜炎患者CSF中的抗BCG－IgG免疫复合物，并与3种类型的结核抗体测定结果比较。结果结核性脑膜炎组CSF特异性IC阳性21例，阳性率64%，而其他疾病患者假阳性3例，假阳性率9%。分析这3例假阳性患者的临床诊断均为化脓性脑膜炎，但其CSF结核抗体测定及TB－DNA扩增结果也为阳性，因此其原因还值得分析。Mathai等也用类似方法检测12例结核性脑膜炎患者CSF特异性IC，结果阳性10例（83%），提示该方法对结核性脑膜炎的辅助诊断也有一定价值。

CSF结核特异性IC测定的临床意义在于辅助诊断结核性脑膜炎、判断疗效和预后。结核特异性IC由抗原与相应的抗体结合所形成，如免疫复合物长期存在于体内，表明体内存在MTB或其抗原，如IC持久高浓度存在于体内，说明机体不能有效清除MTB及其相应抗原。此外，IC尚可在体内导致某些病理性损害，故检测患者IC可辅助判断疗效和患者预后。

（七）细胞因子测定

1．TNF测定 TNF是由单核巨噬细胞产生的细胞因子，具有抗肿瘤、抗感染等多种生物活性。为探讨TNF在结核性脑膜炎患者CSF中的含量变化及其临床意义，有学者采用双抗体夹心ELISA法检测结核性脑膜炎患者CSF及血清中TNF浓度，发现结核性脑膜炎患者CSF中TNF浓度明显升高（平均271．5pg／ml），阳性率达83．9%，而结核性脑膜炎血清及对照组CSF和血清TNF浓度均在正常范围（＜100pg／ml）。赵中等检测了31例结核性脑膜炎患者CSF中TNF浓度，26例TNF浓度增高，出现时间早，持续时间长，有效治疗后可降至正常，而22例病毒性脑炎CSF中TNF浓度正常。研究提示检测CSF中TNF浓度可作为鉴别结核性脑膜炎和病毒性脑炎的主要参数之一，较其他CSF非特异性参数更具敏感性和特异性。该方法快速、敏感、简便，值得临床实验室推广应用。程道胜等还探讨了结核性脑膜炎患者CSF中TNF－α及其可溶性受体（sTNFRs）的变化和临床意义，并进行了治疗前及治疗后1个月内TNF－α和sTNFRs的动态观察。结果表明治疗前结核性脑膜炎患者CSF中TNF－α和sTNFRs水平分别为（10±6）ng／L和（4．8±2．7）μg／L，明显高于非感染性中枢神经系统疾病患者（P＜0．001），且在抗结核治疗1个月内仍较高，但与治疗前相比sTNFRs水平明显降低（P＜0．01），而TNF－α水平降低不明显。该结果提示sTNFRs水平的变化与炎症反应的强弱有关，对结核性脑膜炎病情的反映较TNF更灵敏，因此CSF中sTNFRs的水平检测有助于结核性脑膜炎病情转归及治疗效果的判断。

2．IL－2受体测定 为探讨结核性脑膜炎的发生与免疫功能的关系，谢长华等采用双抗原夹心ELISA法检测了30例儿童结核性脑膜炎和20例对照患儿CSF可溶性白细胞介素－2受体（sIL－2R）水平。结果表明结核性脑膜炎患儿CSF中sIL－2R水平为（300±145．43）U／ml，显著高于对照组（52．6±11．39）U／ml，P＜0．01。研究同时表明治疗后10d和20d患儿CSF的sIL－2R水平较治疗前明显下降，且患儿的临床症状也明显改善。上述结果提示，测定CSF中的sIL－2R水平可为结核性脑膜炎病情监测提供一个新的指标。CSF其他种类的细胞因子测定也有报道，但应用数量较少，故其临床意义还需进一步验证。

（八）细胞E花环形成和淋巴细胞转化实验

Naggar检测18例结核性脑膜炎患者外周血淋巴细胞活性花环为（32．9±3．31）%，总花环为（47．7±3．83）%，而CSF中活性花环为（45．6±3．86）%，总花环为（65．4±3．43）%，CSF与外周血比较P＜0．01。20例正常人外周血活性花环为（51．1±2．80）%，总花环为（70．6± 1．45）%，结核性脑膜炎外周血与正常人外周血比较P＜0．01。笔者认为结核性脑膜炎CSF中T细胞数比外周血T细胞数增多，具有诊断意义。Kinnman报道用PPD刺激结核性脑膜炎患者，CSF中淋巴细胞转化率高于外周血中淋巴细胞转化率，认为结核性脑膜炎CSF中淋巴细胞对PPD的反应是特异性的，可作为诊断早期结核性脑膜炎的一项有价值指标。

四、分子生物学诊断

近年来，分子生物学技术在结核性脑膜炎诊断与鉴别诊断中的研究与应用报道日趋增多，尤其是PCR因具有敏感性高、特异性强、快速等特点，这对于MTB这类难于培养或生长缓慢的病原菌的研究与诊断具有重要意义。PCR敏感性极高的原因有PCR检测MTB的灵敏度为10～100fg（相当于10～20个MTB的DNA）。能查出活菌、死菌、经治疗后的低活力菌与变异的L型结核菌。与传统的各种检查方法比较，PCR检测是目前结核性脑膜炎快速与早期诊断中最理想、实用价值极高的手段。

1．CSF的PCR快速检测 PCR是基因扩增方法代替了传统的生物学扩增（培养）方法，一般2～3d可以报告结果（快者仅5h出结果），国内潘毓萱等报道PCR可检测出10pg MTB纯化DNA和10～50个活菌单位。特异性测验表明，用100ng非分枝杆菌如链球菌、肺炎球菌、肺炎杆菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和人染色体纯化DNA为模板，进行MTB的DNA特异性片段扩增，结果均为阴性。庄玉辉等用17种分枝杆菌DNA进行PCR扩增以考核其特异性，结果除MTB、牛型结核分枝杆菌DNA以及BCGDNA可见扩增带外，其他MOTT均未见任何扩增带，说明特异性良好。

大量的研究表明PCR技术诊断结核性脑膜炎的阳性率高于CSF涂片镜检AFB和培养分枝杆菌。Caws等采用MTB的IS6110PCR扩增131份CSF特异性MTB的DNA片段，结果敏感性为75%，特异性为94%。笔者认为该法可作为结核性脑膜炎常规实验室诊断方法。Shankar等对20例高度可疑、7例可疑结核性脑膜炎患者和5例对照患者的CSF进行MTB的DNA扩增，结果试验组阳性率分别为75%和57%，而对照组无1例阳性。Gupta等的结果表明33例临床诊断的结核性脑膜炎患者CSFMTB的DNA扩增阳性18例，阳性率54%；34例对照患者假阳性2例，假阳性率6%。还有结果表明PCR检测结核性脑膜炎患者CSF，敏感性比涂片镜检AFB高43．1%，比培养分枝杆菌高约50%。国内潘毓萱等应用PCR技术直接扩增CSF中MTB的65KD抗原编码基因片段，结果80例结核性脑膜炎患者中的68例扩增阳性，敏感性85%；而63例非结核性脑膜炎患者CSF62份扩增阴性，特异性为98．4%。PCR与常规细菌学检查对比研究表明，61份结核性脑膜炎患者CSF涂片和（或）培养阳性者共8份，阳性率仅13．1%；而PCR扩增阳性53份，阳性率为86．9%。在细菌学常规检查阴性的53份结核性脑膜炎患者CSF中，PCR扩增46份阳性，阳性率为86．8%。庄玉辉等报道PCR检测58例结核性脑膜炎及17种分枝杆菌和10种非分枝杆菌TB－DNA片段，发现MTB、牛型结核分枝杆菌和BCG有165bp区带，阳性率51．7%，而对照组全部阴性。高薇薇等对临床确诊的52例结核性脑膜炎患者CSF进行PCR、ADA、BACTERTB系统、涂片及结核抗体多项指标检测分析，结果表明PCR阳性率最高，达57．9%，而BACTEC－TB460系统和集菌涂片AFB的检出率仅为7．9%～18．2%。薛承岩等对102份结核性脑膜炎患者CSF进行TB－DNA扩增，结果阳性83份，阳性率81．4%；而40份非结核性的中枢神经系统疾病患者CSF均未检出TB－DNA。王宁山等的结果表明结核性脑膜炎组CSF中TB－DNA扩增阳性率为81%（43／53），而对照组均为阴性。结果同时表明PCR在结核性脑膜炎早期诊断更有优越性，本组病例中有1例发病3d即被检出阳性，4例于发病10d内检出阳性；而这时结核抗体仅检出2例阳性。

尽管PCR是一项良好的实验技术，但其在结核性脑膜炎诊断研究中的应用仍存在一些问题。关键是有一定的假阳性和假阴性。假阳性问题主要与实验室污染、引物特异性不高和操作不当有关。假阴性主要与标本前处理及DNA抽提方法不当、或试剂质量不过关及标本中存在抑制因子和MOTT感染等因素有关。若进一步规范实验室格局、建立标准化操作体系，并加强质控管理，将假阳性、假阴性降低至最低限度，PCR就有可能成为结核性脑膜炎有效的辅助诊断方法。

2．色谱技术检查 对结核菌菌体成分及产物的生化：学检测，主要使用色谱技术，近年文献报道，色谱技术对分枝杆菌的菌型鉴定，结核性脑膜炎的快速诊断与结核杆菌的药敏实验，均有临床实用价值。在色谱技术中以气相色谱（GC）的功能最多，它可以检测分枝杆菌属的分支菌酸（MA）、脂肪酸（FA）、单糖与特异组分，并能做甲基化裂解和耐药实验，即GC，可用于诊断、菌型鉴定和药敏实验，是最常用，具有快速、微量与敏感性高的特点。用于药敏实验比常规法提前2～3周出报告，即6～7d报告。Brooks用带电俘获检测器的GC检测75份CSF中的结核菌硬脂酸（TBSA），特异性91%，敏感性95%。Mardh用气相色谱质谱分析法检测结核性脑膜炎的CSF十分敏感，1～2d可以获得结果。陈氏用气相色谱检测CSF中TBSA43例结核性脑膜炎全部阳性，40例非结核性脑膜炎全部阴性。色谱技术检测有助于结核性脑膜炎的早期诊断。