荧光素标记抗体的原理及方法

时间分辨荧光免疫分析（time－resolved　fluoroimmunoassay，TRFIA）是20世纪80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。其主要特点是以镧系元素铕（Eu3＋）等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽，操作简便，标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。

【原理】　与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。

镧系元素铕（Eu）、钐（Sm）、铽（Tb）和钕（Nd）通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。

镧系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出镧系离子，然后与荧光增强液中的β－二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强镧系荧光免疫分析（dissociation－enhanced－lanthanide　fluoroimmunoassay，DELFIA）。

镧系元素的发光时间延长，如Eu3＋和Sm3＋的荧光衰变时间分别达到4．3× 105　ns和4．1×104　ns，而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4～10ns，通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。此外，镧系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，stokes位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。

【试剂组成】

1．Eu3－标记物　可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。密封后4℃或－20℃保存，但应避免反复冻融。若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。

2．固相抗体或抗原　固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。

包被抗原纯度要求高；包被抗体要求效价高，亲和力强。包被后经牛血清白蛋白封闭，干燥后在4℃、密封、避光、干燥的环境中保存。

3．增强液　试剂纯度不高、器皿清洁度不良或不明原因的污染均可导致增强液荧光本底升高。因此必须注意试剂的纯度；批号的差异，器皿要用10g／L的EDTA·Na2溶液浸泡，再用三蒸水洗涤。新配制增强液应用100ml塑料瓶在4℃下保存。

4．校准试剂或标准品　指用生物液或缓冲液配制的一组不同浓度的待测物质溶液，用于制作计量－反应曲线或用作阴、阳性对照和cut　off值校准。其浓度已用法定标准物为基准进行标定，标示值与实测值的偏差不得超过±10%。蛋白质类生物活性物质应进行免疫活性测定，证明其同质性。4℃或－20℃保存。

5．质量控制样品　参见放射免疫部分。

【检测步骤】　以Wallac公司auto　DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统测定hTSH为例，其免疫反应原理为双抗体夹心法，全部试验过程均在auto DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统上按预设程序自动完成，整个检测过程用时约2．5h左右。步骤如下：

（1）将100μl样品或标准品按顺序加入抗体包被的微孔条中。

（2）每孔加入100μl稀释过的Eu3＋标记抗体工作液。

（3）孵育2h。

（4）洗涤6次，除去游离Eu3＋标记抗体。

（5）每孔加增强液200μl，反应5min。

（6）测定荧光强度并经数据处理计算待测物质浓度。

【资料保存及报告要求】　所有原始记录应妥善保存，以被查考。

报告内容包括患者姓名、编号、项目、送检日期、测定日期、测定结果和正常参考值，推荐使用计算机管理系统对资料进行储存、分类、查询、报告、收费和制作统计报表。

【质量控制】　见放射免疫部分。

【注意事项】　TRIFA法易受内源性和外源性污染，因为在自然环境中镧系离子存在十分广泛，如空气中的尘埃、烟雾，北方地区尤甚。故须严格控制实验条件，防止污染。

1．器材的清洁度　实验所用的一切器材，包括微孔条、加样器、加样头、试剂瓶必须专用，并经严格洗涤，方法是：2mol／L盐酸浸泡24h，再经0．1%环化二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸泡2～4h，蒸馏水冲洗3～5次，再用高纯度蒸馏水冲洗2或3次，45～50℃干燥后密封储存。

2．蒸馏水的质量　蒸馏水的纯度直接影响所制的缓冲液、增强液和洗涤液的本底荧光，通常要求采用三蒸水，最后一次蒸馏采用亚沸石英蒸馏器处理。

3．其他

（1）所有实验用试剂必须作本底荧光测定，首先测增强液本底荧光，应＜1　500cps，其余试剂各取25μl，加增强液200μl，振荡15min，放置20min后测荧光强度，以不高于增强液本底荧光30%为合格。

（2）操作者必须严格执行操作规程。不得用手直接接触加样头尖部、微孔条的孔部，加样完成后应在微孔条上贴上同样大小的胶纸以防尘埃污染，Eu3＋标记物制备场所应与分析实验场所严格分开，以防大计量Eu3＋污染环境。