电化学发光免疫分析

【原理】　电化学发光是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，主要反应物质包括三联吡啶钌（［Ru（bpy）3］2＋）和电子供体三丙胺（TPA）。在电场中的阳电极表面［Ru（bpy）3］2＋和TPA可同时失去一个电子而发生氧化反应，，二价的［Ru（bpy）3］2＋被氧化成三价［Ru（bpy）3］3＋，这是一种强氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA＋＊，它很不稳定，可自发地失去一个质子，形成自由基TPA＊，这是一种很强的还原剂，可将一个电子递给三价的［Ru（bpy）3］3＋，使其形成激发态的［Ru（bpy）3］2＋＊。［Ru（bpy）3］2＋＊不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复成基态的［Ru（bpy）3］2＋＊。这一过程可以在电极表面周而复始地进行，仅消耗TPA，而作为标记物的［Ru（bpy）3］2＋不被消耗，因此一个［Ru（bpy）3］2＋可产生许多信号光子，大大增强了信号强度。

电化学发光免疫检测系统是以［Ru（bpy）3］2＋为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应（反应方式类同于其他化学发光技术）和电化学发光反应分析待测物的含量。现以Roche公司Elecsys电化学发光系统为例加以说明。

【试剂盒】

1．校正试剂　参见时间分辨荧光免疫分析。

2．标记抗原或抗体　［Ru（bpy）3］2＋经N羟基琥珀酰胺酯（NHS）化学修饰后可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且［Ru（bpy）3］2＋NHS分子量较小，不易影响被标记物的免疫活性和可溶性。

3．生物素化抗体或抗原　链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价特异性结合能力的一对化合物，一分子SA可结合四分子B，Elecsys的试剂中，抗体或抗原与活化的B结合，进而可通过B与固相微粒表面的SA结合达到分离免疫复合物的目的。

4．固相载体　固相载体是带有磁性的直径约2．8μm的聚苯乙烯微粒，将SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在固相微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。

5．其他　TPA溶液和洗涤液。

【检测步骤】　全部试验过程均在Elecsys全自动电化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成。以双抗体夹心法为例，检测步骤如下：

（1）在试管中加入待测样品、［Ru（bpy）3］2＋标记抗体、生物素化抗体，37℃反应5～10min。

（2）加入SA磁性微粒，37℃反应5～10min，反应液输入流动池，磁性微粒在磁铁吸引下迅速沉积，附着在流动池底部的电极表面，其余反应液流出流动池，完成免疫复合物和游离成分的分离。

（3）将TPA溶液送入流动池，将残存的游离成分排出流动池，使流动池中充满TPA溶液。

（4）撤下磁铁，电极通电，［Ru（bpy）3］2＋与TPA发生电化学发光反应，发出的光被光电倍增管收集。

（5）经换算得到待测物浓度。

（6）向流动池中送入清洗液，彻底冲洗除去反应物，即可测定下一个标本。

【资料保存及报告要求】　参见时间分辨荧光免疫分析。

【质量控制】　见放射免疫部分。

【注意事项】

（1）应严格按照仪器说明书要求做好维护保养工作，保持管路清洁畅通。

（2）所有定标液和质控液在操作前必须在20～25℃。