维生素A(vitamin A)又叫视黄醇(retinol)，是一种不饱和的一元醇类，属脂溶性维生素。由于人体或哺乳动物缺乏维生素A时易出现干眼病，故又称为抗干眼醇。已知维生素A有A1和A2两种，A1存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又称为视黄醇; 天然维生素A主要以A1形式存在。A2主要存在于鱼的肝脏中，也称为3-脱氢视黄醇。维生素A1是一种脂溶性淡黄色片状结晶，熔点为62～64℃，维生素A2熔点为17～19℃，通常为金黄色油状物。
维生素E(vitamin E)又叫生育酚(tocopherol)，有8种异构体，分别为α-，β-，γ-， δ-生育酚和α-，β-，γ-，δ-生育三烯酚。以α-生育酚的活性最高，通常以其作为维生素E的代表。维生素E是黄色油状物，广泛分布于动、植物中，以各种粮食的胚和植物油中含量较高。
1.高效液相色谱法测定维生素A和维生素E
1)原理
试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。
2)试剂
①无水乙醚: 不含有过氧化物。
过氧化物检查方法: 用5m L乙醚加1m L10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色; 或加4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙醚需去除过氧化物后使用。
去除过氧化物的方法: 重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许; 弃去10%初馏液和10%残馏液。
②无水乙醇: 不得含有醛类物质。
醛类物质检查方法: 取2m L银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
脱醛方法: 取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50m L。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。
③无水硫酸钠。
④氢氧化钠溶液(100g/L)。
⑤硝酸银溶液(50g/L)。
⑥氢氧化钾溶液(1+1): 取50g氢氧化钾溶于50m L水。
⑦抗坏血酸溶液(100g/L): 临用前现配。
⑧甲醇: 重蒸后使用。
⑨重蒸水: 水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。
⑩银氨溶液: 加氨水至硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。
维生素A标准液: 视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1m L，相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。
3)仪器与设备
①高压液相色谱仪，带紫外分光检测器。
②旋转蒸发器。
③高速离心机，配有具塑料差的小离心管(1.5～3.0m L)。
④高纯氮气。
⑤恒温水浴锅。
⑥紫外分光光度计。
4)分析步骤
(1)试样处理
①皂化: 准确称取1～10g试样(含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中，加30m L无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5m L10%抗坏血酸，苯并［e］芘标准液2.00m L，混匀。加10m L氢氧化钾溶液(1+1)，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。
②提取: 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50m L水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100m L乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。
③洗涤: 用约50m L水洗分液漏斗中的乙醚层，用p H试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次增加振摇强度)。
④浓缩: 将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250～300m L球形蒸发瓶内，用约100m L乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2m L乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00m L乙醇，充分混合，溶解提取物。
将乙醇液移入一小塑料离心管中，5000r/min离心5min。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容，并记下体积比。
(2)标准曲线的制备
①维生素A和维生素E标准浓度的标定: 取维生素A和各维生素E标准液各若干微升，分别稀释至3.00m L乙醇中，并按给定波长测定各维生素的吸光值。用此吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表10-2所示。
表10－2 维生素A和维生素E标准曲线的测定条件
浓度计算公式:
式中: c——维生素浓度，g/m L;
A——维生素的平均紫外吸收值;
V——加入标准溶液的量，μL;
E——某种维生素1%比吸光系数;
②标准曲线的制备: 本方法采用内标法定量。把一定量的维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及内标苯并［e］芘液混合均匀。选择合适的灵敏度，使上述物质的各高峰约为满量程70%为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并［e］芘的浓度值不变)，用此种浓度的混合标准液进行色谱分析，结果见色谱图(图10-1)。
图10－1 维生素A和维生素E色谱图
维生素标准曲线绘制: 以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标、维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用两点内标法进行定量。
(3)高效液相色谱分析
预柱: ultrasphere ODS10μm，4mm×4.5cm。
分析柱: ultrasphere ODS5μm，4.6mm×25cm。
流动相: V甲醇V水=98 2混匀，于临用前脱气。
紫外检测器波长: 300nm。量程0.02AUFS。
进样量: 20μL。
流速: 1.7m L/min。
(4)试样分析
取试样浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性分析和定量分析。
定性分析: 用标准物色谱峰的保留时间定性。
定量分析: 根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，根据此比值在标准曲线上查得其含量。或用回归方程求出其含量。
5)结果计算
式中: X——某种维生素含量，mg/100g;
c——由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/m L;
V——试样浓缩定容体积，m L;
m——试样质量，g。
6)说明及注意事项
①高效液相色谱法测定维生素A和维生素E是近几年发展起来的方法，此法能快速分离、同时测定维生素A和维生素E。最小检出量分别为维生素A: 0.8ng; α-E: 91.8ng; γ-E: 36.6ng; δ-E: 20.6ng。
②维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。
③在皂化过程中，应每5min摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。
④提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。
⑤洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。
⑥无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。
⑦在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。
⑧用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品被吹出瓶外使结果偏低。
⑨计算结果保留三位有效数字。本方法测量结果在重复性条件下获得的两次独立测量结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
2.比色法测定维生素A
1)原理
在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑可相互作用，生成蓝色可溶性配合物，其颜色深浅与溶液中维生素A的含量成正比。该蓝色物质在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。
2)试剂
①无水硫酸钠。
②乙酸酐。
③无水乙醚: 不含过氧化物。
④无水乙醇: 不含醛类物质。
⑤三氯甲烷: 不含分解物，否则会破坏维生素A。
检查方法: 三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水少许摇振，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。
处理方法: 试剂应先测验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏。
⑥250g/L三氯化锑-三氯甲烷溶液: 用三氯甲烷配制三氯化锑溶液，将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100m L三氯甲烷的棕色试剂瓶中，振摇，使之溶解，再加无水硫酸钠10 g，用时取上清液。
⑦氢氧化钾溶液(1+1)。
⑧酚酞指示剂(10g/L)，用95%乙醇配制。
⑨维生素A标准溶液。
视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为每毫升维生素A标准溶液相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。
维生素A标准溶液浓度的标定: 取维生素A标准溶液10.00 μL，用乙醇稀释成3.00m L，临用前用紫外分光光度法测定维生素A的吸光度，计算出维生素的浓度。
3)仪器和设备
①分光光度计。
②回流冷凝装置。
4)操作步骤
(1)样品处理
根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。
Ⅰ.皂化法: 适用于维生素A含量不高的样品(可减少脂溶性物质的干扰，但费时，维生素A易损失)。
①皂化: 准确称取0.5～5g经组织捣碎机捣碎或充分混匀的样品于三角瓶中，加入10m L氢氧化钾(1+1)及20～40m L乙醇，于电热板上回流30min，至皂化完全。加入10m L水，稍稍振荡，若无浑浊现象则已皂化完全。
②提取: 将皂化瓶内混合物移至分液漏斗，以30m L水分两次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，如洗液中有渣子，则用脱脂棉过滤。再用50m L乙醚分两次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，振摇2min并注意放气。静置分层后，水层放入第二个分液漏斗中。再用30m L乙醚分两次冲洗皂化瓶，洗液倾入第二个分液漏斗。振摇后，静置分层，水层放入第三个分液漏斗中，乙醚层与第一个分液漏斗中的合并。重复至水液中无维生素A为止。
③洗涤: 用30m L水加入第一个分液漏斗中，轻摇，静置片刻，放去水层，加15～20m L 0.5mol/L氢氧化钾溶液于分液漏斗中，轻摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。再用水洗涤，每次用水约30m L，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止(约3次)。醚层液静置10～20 min，小心放出析出的水。
④浓缩: 将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25m L乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠2次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。直到瓶中剩约5m L时取下，用减压抽气法抽干，立即加入一定量的三氯甲烷，使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内(3～5μg/m L)。
Ⅱ.研磨法: 适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定(步骤简单，结果准确)。
①研磨: 精确称取2～5g样品，放入盛有3～5倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化以达到细小均匀。
②提取: 小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50～100m L乙醚，紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中，使其自行澄清(1～2h)或离心澄清10min(3000r/min)。气温高时应在冷水浴中操作，以防乙醚挥发。
③浓缩: 取澄清乙醚液2～5m L，放入比色管中，在70～80℃水浴上蒸干，立即加入1 m L三氯甲烷溶解残渣。
(2)标准曲线的绘制
准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列使用液。再取相同数量比色管顺次取1m L三氯甲烷和标准系列使用液1m L，各管加入乙酸酐1滴制成标准比色系列。于620nm波长处，以10m L三氯甲烷加1滴乙酸酐调零，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9m L三氯化锑-三氯甲烷溶液，于6秒内测定吸光度(每支比色管都在临测前加入显色剂)，以维生素A含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘出标准曲线图。
(3)样品测定
在一支比色管中加入10m L三氯甲烷，加入1滴乙酸酐为空白液。另一支比色管中加入1m L三氯甲烷，其余比色管中分别加入1m L样品溶液及1滴乙酸酐，其余步骤按标准曲线的制备。分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素A的含量。
5)结果计算
式中: X——样品中维生素A的含量，mg/100g(若按国际单位，1IU=0.3μg维生素A);
c——由标准曲线上查得样品溶液中含维生素A的含量，μg/m L;
m——样品质量，g;
V——提取后加三氯甲烷定量之体积，m L;
100/1000——将样品中维生素A由μg/g换算成mg/100g的换算系数。
6)说明及注意事项
①本法适用维生素A含量大于5μg/g的样品，对含量低的样品准确性低。
②乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。
③所用氯仿中不应有水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫升氯仿中加一滴乙酸酐，以保证脱水。
④三氯化锑腐蚀性强，不能粘在手上; 由于三氯化锑遇水产生沉淀，因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。
⑤由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s后便开始退色，因此要求反应在比色杯中进行，产生蓝色后立即读取吸光度。
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