吸光光度分析方法

11．5．1 经典光度分析方法

1．校准曲线法

最基本的吸光光度分析方法是直接利用朗伯－比尔定律，在一定条件下制作校准曲线（标准曲线，或工作曲线），以测得的吸光度值对被测组分进行定量。

在确定的最佳显色反应条件和最佳测量条件下，分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中被测组分的含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制A－c曲线，即校准曲线。现代分析中大多要求以最小二乘法处理制作校准曲线的实验数据，得到一元线性回归方程。

由朗伯－比尔定律可知，校准曲线的斜率为κb，而在测定中b为定值不变，故可由曲线的斜率求出κ。当需要对某未知液的浓度cx进行定量测定时，只需在相同条件下测得未知液的吸光度Ax，就可直接在校准曲线上查得或计算出未知液的浓度cx。

2．示差光度法

由前述已知，普通光度法只适用于测定微量或痕量组分，而不适用于常量分析。当待测组分浓度过高时，即使不偏离朗伯－比尔定律，但由于吸光度超出准确测定的读数范围，也会引起很大的测量误差，导致准确度降低。在待测组分浓度过高的情况下，可采用示差光度法分析，以获得较为准确的分析结果。

示差光度法与普通光度法的主要区别在于它所采用的参比溶液不同，它不是以c＝0的试剂空白为参比，而是以一个浓度比待测试液cx稍低的标准溶液cs为参比 （调节仪器的T＝100％，A＝0），然后再测定试液的吸光度。依据朗伯－比尔定律可得：

Ax＝κbcx

As＝κbcs

实际测得的试液的吸光度 （示差吸光度）Af为：

Af＝Ax－As＝κb（cx－cs）＝κbΔc

由上式可知，所测示差吸光度Af与浓度差Δc成正比，制作Af－Δc曲线 （亦可直接利用以空白溶液作参比制作的稀溶液校准曲线），根据Af得到Δc值，进而从cx＝cs＋Δc求出待测试液的浓度cx。

示差光度法由于扩展了读数标尺，使吸光度读数落在测量误差较小的区域，从而使高浓度待测组分测量的准确度大大提高。但示差光度法对仪器光源的要求较高。

3．解联立方程法

当试样中含有多种吸光组分时，如果各测定组分的吸收曲线之间相互重叠，也可利用吸光度的加和性对多组分进行同时测定。设混合物中含有x和y两种组分，测定时根据x组分和y组分的吸收曲线，选择各组分的λmax为测量波长λ1和λ2，分别在两个波长下测定混合物的总吸光度，根据吸光度的加和性原理联立方程：

分别测得纯x和纯y溶液在λ1及λ2波长处的摩尔吸收系数，解上述方程组即可求得混合物中各组分的浓度cx和cy。显然，同时测定的组分越多，计算工作量越大，借助于计算机则可大大提高多组分同时测定的效率和准确度。

11．5．2 双波长分光光度法

在经典的光度分析中，常会因共存组分与被测组分的吸收谱带重叠而干扰测定，有时也会存在溶剂、胶体、悬浮体等散射或吸收辐射引起的背景干扰。采用双波长分光光度法可以解决这些干扰问题。

1．双波长分光光度法的原理

在单波长分光光度法中，通常是先用参比溶液调节仪器零位，然后再将试样溶液推入光路测定。这样，参比溶液和试样溶液的液池位置、液池的光学性质、溶液浊度、溶液组成以及仪器和测量条件的微小变化等任何差异，都会直接导致误差。而双波长分光光度法只用一个试样池，从光源发射出来的光线被分成两束，分别经过两个单色器而得到两束波长不同的单色光。借助切光器使这两道光束以一定的频率交替通过试样池，最后由检测器显示出试液对波长为λ1和λ2的两束光的吸光度差值ΔA。

设波长为λ1和λ2的两束单色光的强度相等，则有：

Aλ1＝κλ1bc＋Ab1

Aλ2＝κλ2bc＋Ab2

式中，Ab1和Ab2分别表示背景和干扰物质的吸收。若波长选择合适，使Ab1等于Ab2，则有：

ΔA＝（κλ1－κλ2）bc

可见ΔA与吸光物质的浓度成正比，且基本上消除了试样背景和干扰物质的影响，这是用双波长分光光度法进行定量分析的理论依据。

2．波长组合的选择

在双波长分析法中，波长λ1和λ2的组合和选择是此分析方法的关键。当两个或更多组分共存，且吸收光谱有重叠时，通常采用等吸收点法来选择参比波长和测定波长。所谓等吸收点法是指干扰组分在所选的两波长处具有相同的吸光度，这样测得的吸光度差就只与待测组分的浓度呈线性关系，从而消除干扰。选择参比波长和测定波长时，还应使被测组分在这两个波长处具有较大的吸光度差，这样才可保证测定具有足够高的灵敏度。例如，测定苯酚与2，4，6－三氯苯酚混合物中的苯酚时，由图11－9可见，选择苯酚的最大吸收波长λ2为测量波长，三氯苯酚在此波长处也有较大吸收，产生干扰。为此，在波长λ2处作垂线，它与三氯苯酚的吸收曲线相交于一点，再过此交点作一与横轴平行的直线，它与三氯苯酚的吸收曲线相交于λ1和λ′1两点，这几个交点处的吸光度相等。如果选择波长λ1和λ′1作为参比波长，则可以消除三氯苯酚对苯酚测定的干扰。

用双波长分光光度法以形成有色络合物测定某组分时，若没有共存组分干扰，选择络合物吸收峰作测量波长，选择显色剂的吸收峰作为参比波长，则可获得比单波长法更高的测定灵敏度。

图11－9 2，4，6－三氯苯酚存在下苯酚的测定

3．双波长法的作用及特点

（1）取代参比溶液的作用

若在测定波长λ2和参比波长λ1处，比色皿和试液的反射和其他吸收相同，则双波长法中的参比波长可取代普通吸光光度法中参比溶液的作用，两个波长处测得的吸光度差值ΔA已经消除了反射和其他吸收的影响。

在波长λ2和λ1处，反射相同的条件通常是可以满足的；其他吸收相同的条件，可通过上述介绍的等吸收波长法，找出与测定波长λ2处有相同吸收的其他波长λ1。

双波长法取代参比溶液，不但操作简单，而且可以消除在普通吸光光度法中，由于测量皿和参比皿可能存在的光学性质差异对入射光的反射和吸收不同而引起的误差。

（2）多组分的分别测定

按上述介绍的原理，在多组分溶液中，依次以某一组分作待测组分，以其他组分作干扰组分，选择合适的测定波长和参比波长，可对溶液中的不同组分分别进行测定。

用双波长法对多组分进行分别测定，避免了采用11．6．3中介绍的方法对多组分同时测定时需解联立方程的麻烦。

（3）混浊溶液的测定

若在测定波长λ2和参比波长λ1处，因试液的混浊引起的对入射光的散射是相同的，则双波长法可用于测定混浊溶液。入射光没有散射是朗伯－比尔定律的使用条件之一，当试液存在散射时，虽然理论上可用相同混浊的参比溶液消除散射，但实际操作中配制有相同混浊的参比溶液是比较困难的，因此普通吸光光度法一般不能用于测定混浊溶液。但在双波长法中，只要测定波长λ2处的散射与参比波长λ1处相同，便可消除由于混浊引起的散射，而当λ2与λ1相差不大时，这个条件通常是可以满足的。因此，双波长法可用于测定混浊溶液。

11．5．3 催化光度法

催化光度法是一种动力学分析法，通过测量反应速率来进行定量分析。许多化学反应在催化剂的存在下，可以加快反应速率，而催化反应速率在一定范围内与催化剂的浓度成比例关系，因而以光度法或其他方法检测催化反应速率就可以实现对催化剂浓度的测定。

在催化光度法分析中，既可以催化显色反应作指示反应，又可以催化褪色反应作指示反应，对于反应：

①若产物F为有色化合物，通过检测反应过程中F组分的吸光度以确定反应速率，则：

当反应物D和E过量，在检测过程中浓度变化可以忽略的情况下，K1c Dc E合并为K2，上式可简化为：

积分得：

则t时刻F组分的吸光度由朗伯－比尔定律可得：

此式即为以显色反应为指示反应的催化光度法的基本关系式。

②若反应物D为有色化合物，通过检测反应过程中D组分的吸光度以确定反应速率，则：

当E过量时，c E可视为常数，与K3合并为K4，则：

积分得：

以D组分在零时刻的吸光度A0和t时刻的吸光度At来表示，则：

此式即为最常用的以褪色反应为指示反应的催化光度法的基本关系式。

常用的催化光度法有固定吸光度法、固定时间法和斜率法，其中固定时间法最为简单。

催化光度法具有极高的测定灵敏度，检出限一般为10－10～10－8g／m L，甚至有时可低至10－12g／m L。但影响该法测定准确度的因素较多，操作要求严格，测量精度较差。