细菌接合和遗传重组

经典遗传学是在研究高等动植物在有性生殖过程中反映的遗传和变异规律的基础上发展和建立起来的，它对于细菌和病毒这样的生命形态是否也适用呢？

不少微生物学家曾经探索过细菌中是否存在类似动植物的两性生殖现象，但一直得不到肯定的结果。原因主要有两个：一是无法在形态学上找到细菌之间发生接合或细胞融合的证据，这类证据要在电子显微镜技术发展的基础上才能获得；二是没有把对细菌的性研究和遗传分析结合起来，得不到确实存在遗传重组的判断性依据。20世纪40年代中期，J.莱德伯格在卢里亚和德尔布吕克做的确定细菌突变本质的实验和分析的启示下，开始用遗传学分析的方法来研究大肠杆菌的有性接合和遗传重组。

J.莱德伯格用两种不同的营养缺陷突变型细菌“杂交”来研究细菌之间的遗传重组。例如，大肠杆菌K12的生物素合成缺陷突变菌Bioˉ和亮氨酸合成缺陷突变菌Leuˉ混合培养一段时间后，把菌液涂布在只含碳水化合物而不含氨基酸、也不含其他生长因子的基本培养基上，如果出现了不依赖外源氨基酸和维生素就能生长的野生型细菌，就有可能是两个突变品系的细菌之间的杂交和重组的产物。但是，我们还不得不考虑另一种可能性：如果营养缺陷突变型细菌Bioˉ或Leuˉ发生自发回复突变，也会在基本培养基上形成野生型菌落。因为当细菌重组的频率与回复突变的频率都很低时，例如都在10-6水平时，两者是很难区分的。因此，J.莱德伯格设想如果能用多重缺陷突变型细菌之间的混合培养来研究细菌的重组，就可以将营养缺陷型细菌回复突变为野生型菌的可能性降低到几乎为零，如双重突变菌回复为野生型菌的概率约为10-12（10-6×10-6）。然而，筛选多重营养缺陷突变型是并非容易的事，J.莱德伯格决定和斯坦福大学的塔特姆合作，终于在1946年开始了多重突变品系间的遗传重组研究。图2-1是他们的一个经典实验的示意图。

重组实验的具体步骤如下。

图2-1　细菌遗传重组实验示意

Bioˉ：生物素合成缺陷突变；Metˉ：甲硫氨酸缺陷突变；Proˉ：脯氨酸缺陷突变；Trpˉ：色氨酸缺陷突变；Tlr：噬菌体T1抗性突变，抗性菌；s：噬菌体T1敏感型，野生型菌；Bio＋、Met＋、Pro＋Trp＋为野生型基因（引自D.T.Suzuki）

（1）取大肠杆菌K12的双重营养缺陷突变菌BioˉMerˉ和双重营养缺陷突变菌PrˉTrpˉ在含有各种氨基酸和生长因子的完全培养液中混合培养过夜，离心洗脱完全培养基后涂布于基本培养基上培养。

（2）另取BioˉMetˉ和ProˉTrpˉ菌分别于基本培养基和相应的补充培养基（如含有生物素和甲硫氨酸的培养基，或含有脯氨酸和色氨酸的培养基）或完全培养基上涂布培养。

（3）培养一定时间后，分别计数各类培养基上形成的细菌菌落数。

结果表明在混合培养前，两种双重缺陷型菌株都没有在基本培养基上形成野生型菌落，而在混合培养后涂布的基本培养基上，出现了表型为野生型的菌落，其发生概率约为10-7。

这种具有野生型表型的细菌是不是遗传重组的产物？是不是细菌接合的产物？在回答这个问题之前，还必须排除回复突变之外的另外两种可能性：①不同营养缺陷型细菌之间的互饲；②类似肺炎球菌转化那样的DNA转移。

我们可以来分析J.莱德伯格提出的细菌接合引起遗传重组的假设和上述两种可能情况的区别，确认是细菌接合引起遗传重组的先决条件是细菌菌体之间有过直接的接触，而互饲和转化都不必以不同遗传型菌株细菌菌体之间的物理接触为条件。根据这些分析，戴维斯（B.Davis）在1950年设计了一种U形培养管，把两种营养缺陷突变型细菌分别接种于U形管的两臂，中间用孔径小于0.1 μm的烧结玻璃滤板隔开，这样的微孔可允许DNA或其他具有生物活性的大分子通过，但完整的细菌菌体则不能通过。待细菌生长到适当程度后或达到生理饱和密度时，缓慢地持续抽吸培养液（图2-2）。在这样的条件下，两种营养缺陷突变型细菌是在共享同一培养液，只是不能发生菌体的直接接触。然后用U形管两臂的菌样涂布基本培养基，结果没有出现野生型细菌菌落。戴维斯的实验排除了细菌之间互饲，或由DNA引起转化这两种可能性，证实J.莱德伯格和塔特姆1946年的实验结果确实是两种营养缺陷突变型细菌接合而引起的遗传重组。

然而，要证明基因重组的存在还必须进一步研究基因的分离。根据遗传学原理，作为单倍体的细菌，在涉及2对基因的遗传重组中应产生4种不同的基因型和表型，涉及3对基因的遗传重组应产生8种基因型和表现型。对于细菌的营养缺陷突变的遗传重组实验来讲，各种不同表型的细菌只有在非选择性的完全培养基上才能全部得以生长。然而，细菌的遗传重组率是非常低的，为10-7～10-6，所以不利用选择性培养基是根本不能显示遗传重组产生的杂交菌后代中携有营养缺陷突变标志基因的子裔菌所形成的菌落的。解决这个问题的方法是把选择性标记和非选择性标记结合起来，用选择性标记来选择杂交重组体，用非选择性标记来观察基因的分离现象。

例如做AˉBˉC＋D＋Lac-SrTs与A＋B＋CˉDˉLac＋SsTr两种细菌的杂交实验，可以选用营养缺陷突变Aˉ、Bˉ、Cˉ和Dˉ做选择性标记来观察Lac、S和T三对基因的分离，Lac＋和Lacˉ分别代表能和不能利用乳糖，能利用乳糖的Lac＋菌在含有伊红甲基蓝（eosin-methylene blue，EMB）的培养基上呈红色，而不能利用乳糖的Lacˉ菌则在含有伊红甲基蓝的培养基上仍为灰白色；Ss和Sr分别代表是否具有对链霉素的抗性；Ts和Tr分别代表是否具有对噬菌体T的抗性。实验过程如图2-3。

图2-3　以营养缺陷突变A、B、C、D为选择标记，以Lac、S、T为非选择标记来观察重组和分离现象的示意（引自D.T.Suzuki）

先分别培养参与杂交重组的两株营养缺陷突变菌，并用相应的培养基鉴定各自的遗传性状，即用培养基A确认该菌株除了相应的营养缺陷突变外还具有对链霉素有抗性、对噬菌体T敏感、在EMB培养基上不显色；用培养基B确认该菌株除了相应的营养缺陷突变外还具有对链霉素敏感、对噬菌体T有抗性、在EMB培养基上显示红色。然后将两个菌株混合培养12～24 h使杂交重组得以进行，再将菌液涂布在基本培养基C上，以营养缺陷突变为选择基因筛选出重组菌A＋B＋C＋D＋。接下来逐个挑出培养皿C上的菌落在培养皿D上划线培养。D培养皿在基本培养基的基础上做了些改变：一是添加了EMB以显示所挑出的菌株能否利用乳糖；二是在培养皿的特定位置由上而下涂划链霉素溶液（S）和噬菌体T借以分别显示所挑出菌株的抗性性状。图2-3的培养皿D代表性地显示了Lac＋和Lacˉ、Ss和Sr、Ts和Tr这三对性状的八种组合。这组实验巧妙地运用了多种选择性和非选择性培养基展现细菌的基因重组和分离。图2-4显示的是另一种实验设计，它以链霉素和噬菌体抗性突变为选择标记，筛除了大量没有发生重组的原始菌株。再把营养缺陷突变基因分为两组：一组以A和B为选择基因，借以观察非选择基因C和D的分离；另一组以C和D为选择基因，借以观察非选择基因A和B的分离。这组实验同样展现了细菌在杂交中的基因重组和分离。J.莱德伯格和塔特姆的这一系列完整的实验证实了在细菌中确实存在着类似动植物有性生殖过程，并在这个过程中进行了基因的重组和交换，为遗传学的基本原理应用于微生物奠定了基础。

图2-4　以抗性突变为选择性标记，以营养缺陷突变为非选择性标记来观察重组和分离现象（引自D.T.Suzuki）