到了20世纪60年代末期，分子生物学家看来几乎没有事情可做了：DNA结构搞清楚了、中心法则得到了证实、遗传密码全部破译、关于基因功能表达的操纵子理论也提了出来，杂志上发表的分子生物学论文越来越少。分子遗传学经历了20世纪50年代初开始的黄金时代之后进入了一个相对“寂静”的时期。打破这一寂静，把分子遗传学推入又一个黄金时期的是细菌中限制和修饰现象的发现和研究，以及由此发展起来的DNA重组技术。
早在1952年，美国伊利诺伊大学的卢里亚和他的助手休曼（M.Human）发现了一种非常有趣的现象，噬菌体存在着一种寄主适应性变异，这种变异不是突变和选择的结果，而是完全取决于噬菌体复制和生长的寄主细胞。卢里亚把它称为寄主控制的限制和修饰。从图2-25可以看出，绝大部分在大肠杆菌K12细胞中生长的噬菌体λ（K）不能在经温和噬菌体P1溶原化的溶原性大肠杆菌K12（P1）中生长，而那极少数（约0.002%）能够在K12（P1）中生长的噬菌体，则能在两个菌株中正常地复制和增殖。看来P1的存在有两种作用：①限制绝大多数λ（K）的生长；②修饰和改变了极少数λ（K），使之能以不被限制的形式在K（P1）中生长。但是，这种限制和修饰的机制却是一个长期未被解开的谜。
图2-25 λ噬菌体在K12（P1）中的限制和修饰现象（引自S.Luria）百分数系λ噬菌体在箭头所指的寄主细胞平板上的噬菌斑形成率。
卢里亚论文发表后10年，瑞士日内瓦大学的生物化学家阿尔伯（W.Arber）揭开了这个谜。阿尔伯在美国加州大学工作时曾和卢里亚的助手韦格（J.Weigle）共事，后来又和他的研究生杜西奥斯（D.Dussiox）深入研究了噬菌体λ和两种寄主细胞K12和K12（P1）的关系。在重复卢里亚实验的基础上，他们调整了噬菌体λK（P1）和寄主细胞K12的比例，使每个K12细胞只受一个λK（P1）的感染，然后做单菌释放实验，分析单个细菌释放的λ噬菌体的性质。他们惊奇地发现在一个K12细胞裂解释放的噬菌体中只有一个能感染K12（P1）细胞。阿尔伯认为这个在前一轮寄主K12（P1）中合成的噬菌体的DNA似乎标上了“K12（P1）制造”的标记。深入研究表明这个寄主细胞的“标记”并没有改变噬菌体DNA的核苷酸序列，而是修饰了特定位置上的胞嘧 啶或腺嘌呤，即通过一个甲基化酶将甲硫氨酸上的甲基转移到已完成复制的DNA分子上的特定位置上的胞嘧或腺嘌呤上，使之成为5-甲基胞嘧啶或6-氨甲基嘌呤。为了验证这个想法，阿尔伯又把K12（P1）培养在缺乏甲硫氨酸的培养基中，结果K12（P1）因不能得到甲硫氨酸提供的甲基而不能修饰自身的DNA，最后导致死亡。这个实验同时表明细菌的限制和修饰系统在某种条件下也可作用于自身的DNA而导致自杀。
下一个问题是分离和纯化细菌的限制和修饰性酶。在1958年，为了证实DNA的半保留复制模式而发展和建立了生物大分子密度梯度离心分离法的梅塞尔森又为纯化限制性酶做出了重大贡献。当时梅塞尔森已经在哈佛大学建立了自己的实验室。1966年袁（R.Yuan）取得博士学位后来到梅塞尔森实验室，梅塞尔森给他两个课题任他选择：一是噬菌体T4重组酶的纯化；二是限制性酶的分离。袁不顾前人的多次失败，毅然选择分离限制性酶作为博士后的研究课题，梅塞尔森和袁运用梯度离心技术和透析法，反反复复地整整工作了两年，从大肠杆菌K的120g菌体中提取了8g蛋白质，接着又以酶活性为指标不断浓缩和纯化，最后获得了大约5×10-4g精制蛋白质，这些蛋白质几乎保留了120g菌体所有的全部限制性酶活性。细菌限制性酶制品的纯化和提取揭开了限制和修饰研究的新的一页。年轻的袁在漫长而单调的纯化过程中享受到了创造者的乐趣，多年后他在给友人的信中写道：“这段时期是我一生中最激动人心的时期。”
梅塞尔森和袁用纯化的酶做了一系列实验，发现被标记的DNA经限制性酶处理不会产生游离的标记核苷酸，环状的λ-DNA经限制性酶处理后会成为线状的双链片段，解链变性后也不改变链的长度。这些结果表明限制性酶作用的对象是双链DNA，并且它还是一种内切酶，因为它不切割链端的核苷酸。此外，他们还做了限制性酶处理异源双链分子的实验，他们用在大肠杆菌K上生长的λ噬菌体的DNA（对限制性酶K的作用有抗性）和在大肠杆菌C上生长的λ DNA（对限制性酶K敏感）分别解链后退火形成λ（K）/λ（C）杂合双链，然后用限制性酶K处理。结果λ（K）这条在K细胞中修饰过的单链保护了双链分子，甚至在杂合双链中的λ（C）单链上不产生切口。这表明在DNA双链中，只要有一条链的特定位点被甲基化修饰，那么整个双链分子都不受限制性酶的作用。
梅塞尔森和袁认为这是一项非常重要的发现。因为异源双螺旋分子对限制性酶的抗性，实际上是保护了复制中新合成的一条DNA链，使新链有被修饰的机会和时间。如果限制和修饰由同一种酶完成，那么对DNA分子究竟是进行限制性切割还是保护性修饰反应就完全取决于底物究竟是未经修饰的同源双螺旋，还是有一条单链被修饰的异源双螺旋。
接着梅塞尔森和袁又用了10年时间，终于弄清楚他们所研究的限制性酶K的分子量非常大，它由三个活性组分构成。第一部分专门识别DNA双链分子上的特定碱基序列，第二部分专门在未经甲基保护性修饰的特定区段切割DNA双链，第三部分对异源双分子做保护性修饰。遗憾的是他们并没有进一步研究酶所识别和切割的特异性序列，而这恰恰是限制性酶作用的关键，解决这个问题的是史密斯（H.Smith）。
史密斯早年学习数学，后来又进医学院学习，1962年进入密歇根大学，在噬菌体遗传学家莱文（M.Levine）指导下攻读博士学位，长期从事噬菌体P22的研究。毕业后到了约翰·霍普金斯大学医学院从事嗜血流感杆菌（Haemophilus inffuenzae）的转化研究。为了研究嗜血流感杆菌对外源DNA的作用，他把各种来源的DNA加入这种菌的提取液，并以DNA溶液的黏度改变作为DNA分子断裂和降解的指标来研究细菌提取液对DNA的作用。另外，他还用放射性标记的噬菌体DNA或其他来源的DNA来感染嗜血流感杆菌，并观察这些标记DNA的变化。一次史密斯用放射性标记的噬菌体P22感染嗜血流感杆菌。这种噬菌体是他非常熟悉的实验材料，可意想不到的是这些放射性标记的DNA竟消失得无影无踪。突然，他的脑海中闪出了一个革命性的思想，1978年12月8日，在诺贝尔奖的获奖演说中，史密斯回忆道：“我立刻把我们的实验结果和梅塞尔森的论文联系了起来，我设想这很可能是噬菌体P22的DNA被细菌的限制性酶裂解了，而我们的黏度测定技术可能发展成为一种限制性酶的活性测试系统。第二天，我们装了两个黏度计，一个加入P22的DNA，另一个加入嗜血流感杆菌的DNA。然后加入嗜血流感杆菌的提取液，接下来我们随时测定溶液的黏度变化。随着实验的进行，我们越来越兴奋，因为我们发现嗜血流感杆菌DNA溶液的黏度保持不变，而P22的DNA溶液的黏度急剧下降。我相信我们发现了一种活性非常高的限制性酶。”
接着史密斯和他的助手做了同梅塞尔森和袁几乎一样的工作，从12 L细菌培养液中提取限制性酶。走完了这长长的路，史密斯发现从嗜血流感杆菌中分离到的限制性酶的分子量只有70 000，比梅塞尔森和袁研究的酶要小很多。这种酶能有效地切割双链DNA，例如，它可将长度为40 000 bp左右的噬菌体T7的DNA切成平均长度为1 000 bp左右的40个双链DNA片段，但没有游离的核苷酸出现。他把这种酶定名为限制性内切酶R。到这儿为止，史密斯并不比梅塞尔森和袁多走一步，只是在嗜血流感杆菌中重复了梅塞尔森和袁在大肠杆菌中做的实验和分析。他棋高一着的是进一步分析了限制性内切酶的识别和切割序列。史密斯在他发表的关于嗜血流感杆菌的限制性内切酶R的论文中，就曾推测这种识别序列应由5～6 bp组成。理由是这种内切酶将T7 DNA切成平均长度为1 000 bp的片段，表明它识别和切割序列大约每隔1 000 bp出现一次。根据概率论推算，如果某一序列由4 bp组成，则平均每隔256 bp出现一次，而在T7 DNA上特异性序列平均每隔1 000 bp出现一次，所以构成特异性序列的碱基对数目估计应为5～6 bp。
怎样确定限制性内切酶的识别和切割序列呢？可以设想，如果酶的识别和切割位点确有特异性，那么每一个酶切片段的末端应由相同的碱基组成，只要测定酶切片段末端的碱基构成，就可以确定酶的识别和切割序列了。这正是史密斯的研究战略。经过深入细致的分析，史密斯和他的助手终于攻克了这个难题，查明这个酶的识别和切割序列，这是一个中心对称的回文序列：
这是人类搞清楚的第一个限制性核酸内切酶的识别序列，这个酶被正式命名为Hin dⅡ。
从上面的叙述可以看出，对于限制和修饰的研究步子是越走越快了。
从第一个噬菌体定型到卢里亚发现限制和修饰现象，花了30年（1922—1952年）；
从卢里亚到阿尔伯花了10年（1952—1962年）；
从阿尔伯到梅塞尔森和袁花了6年（1962—1968年）；
从梅塞尔森和袁到史密斯只花了2年（1968—1970年）。
史密斯在回顾这段经历时曾说过一段意味深长的话：“寄主控制的限制和修饰，看来似乎是细菌学中并不显眼的一种现象，可是它导致了一类酶的发现。而这样一件事又出人意料地大大推动了科学的发展。”
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