癌基因诱变的动物实验模型

大量临床实验研究表明ras基因的突变和多种人体癌症直接相关（表8-2），但要搞清楚ras基因在癌变过程中的作用至少有两大困难：①当时许多肿瘤的病理基础尚未确切了解；②不可能用人体做癌变的实验研究。为此，必须建立一个能在基因分子结构水平上研究ras基因和癌变关系的动物实验模型。

早在1975年古利诺（P.M.Gullino）等就报道过，化学诱变剂N-亚硝基-N-甲基脲（NMU）可诱发大鼠的乳腺癌。1983年，巴瓦西德实验室的苏库玛（S.Sukuma）等发现用NMU处理Buf/N大鼠一次即可诱发乳腺癌，并在诱发的癌细胞中检出了有恶性转化活性的H-ras-l基因。很重要的一点是这些由诱变性致癌物激活的H-ras-l基因，具有与人体肿瘤中所发现的几乎完全一样的激活机制。正是这一点，使这个系统成为研究人癌基因转化激活的良好实验模型。

为了探索ras基因在多阶段致癌过程中所起的作用，必须先确定ras基因恶转活化发生的时间段。在NMU诱发大鼠乳腺癌这个系统中，对于确认癌变中ras激活是否发生于启动阶段，有两个有利条件。①大量的研究已经证实NMU可专一性地诱发G到A这个转换突变，专一程度可等于或大于99%。扎布尔（H.Zarbl）在1985年还证实，所有NMU诱发的大鼠乳腺癌中活化的H-ras基因，都在12号密码子的第二个核苷酸，发生了G到A的转换突变；相反，另一种致癌物7，12-甲基苯并蒽（DMBA）诱发的乳腺癌中的活化H-ras基因，诱发的并不是G到A转换。对比NMU和DMBA产生的不同结果，可以较有把握地认为NMU是通过引起G到A转换而引起H-ras基因恶转活化的直接原因。②NMU在生理条件下是极不稳定的，经测定静脉注入的NMU半数失活时间只有20 min，这表明NMU在大鼠体内的作用时间仅有几个小时。就在这段时间内，NMU启动了诱变致癌过程。这些实验研究从不同的侧面说明，如果NMU引起的由G到A的转换造成了诱发乳腺癌中H-ras基因的突变，那么这种突变引起的基因活化是发生在癌变启动阶段的。

图8-9　NMU诱发的大鼠乳腺癌中H-ras基因突变的MnlⅠ多态检测方法

（a）检测原理，圆形黑点是Mnl Ⅰ切点，中间有红色的圆点是因突变而失去的Mnl Ⅰ切点，它涉及12、13两个密码子；（b）检测结果：a为正常乳腺细胞DNA片段；b、c为经NMU诱变产生的乳腺癌细胞DNA片段（改自E.Santos）

NMU诱发H-ras基因第一个外显子中第12号密码子的第二个核苷酸由G转换为A，会使H-ras-l基因失去一个限制性内切酶MnlⅠ的识别和切割序列GAGG，造成有诊断意义的限制性片段长度多态现象（RFLP）。正常的H-ras-l基因的第一个外显子序列分属两个限制性内切酶Mnl Ⅰ切割片段，长度分别为206 bp和74 bp（图8-9），恶转活化的H-ras基因的相应片段由于失去一个Mnl Ⅰ切点，只能产生一个长度为280 bp的Mnl Ⅰ片段。利用一个120 bp的HPaⅡ/SacⅠ片段作为印迹杂交的探针，以Mnl Ⅰ为诊断用内切酶即可进行H-ras的RFLP分析，扎布尔等用Mnl Ⅰ多态检测法测定了用NMU诱发的三种大鼠品系的乳腺癌的DNA样品58份，结果证实其中的48份（占83%）为Mnl Ⅰ多态阳性（表8-3）。在阳性反应的DNA样品中，又有36个（占75%）能引起NIH3T3细胞恶性转化。这表明NIH3T3细胞是具有恶转活性的H-ras基因较为可靠的检测系统。

作为对照，扎布尔又检测了26份取自正常大鼠乳房细胞的DNA，结果无一出现Mnl Ⅰ切割片段的长度多态现象（表8-4）。此外，又做了6只患有非乳腺癌的大鼠的乳房细胞DNA分析，结果亦为Mnl Ⅰ多态阴性。

表8-4　NMU诱发的大鼠乳腺癌的H-ras的MnlⅠ多态检测

*表示其中4只Buf/N和2只Sprague-Dawley大鼠的样品取自非乳腺癌患鼠的正常乳房细胞。

为了进一步证实NMU诱发的是G35到A（35位即12号密码子第二号核苷酸的序号），可合成一个含19个核苷酸的寡核苷酸探针，将要探测的核苷酸设计在探针序列中间，两侧各有9个可与被检DNA片段中相应区段互补的核苷酸。例如，检测G35到A变异可用下列寡核苷酸探针组合：

H19g35探针：5′-TGGGCGCTGG*AGGCGTGGG-3′

H 19 A35探针：5′-TGGGCGCTGA*AGGCGTGGG-3′

在适宜的杂交条件下，标记的H 19g35探针能和来自正常细胞的相应DNA酶切片段杂交形成互补双链，但不能和来自NMU诱发的乳癌细胞中同样的DNA酶切片段杂交。相反，标记的H19 A35探针只能和NMU诱发的乳腺癌细胞中的相应DNA片段形成杂合双链，但与正常细胞的相应DNA片段不能杂交。这个实验证据非常有力地表明NMU确有特异性极高的诱发G到A突变的能力。

综上所述，用NMU一次处理诱发大鼠乳腺癌是一个可以在分子水平分析癌基因Ha-ras的动物致癌模型。利用这个实验模型已经探明下列几点。

（1）NMU诱变具有很高的专一性，对它诱发的大鼠乳腺癌讲，诱变部位是Ha-ras-l基因的G35到A的转换突变。

（2）Ha-ras基因的恶转活化发生于癌变的起始阶段。

（3）大鼠乳腺癌的Ha-ras基因的恶转活化机制和人体中某些肿瘤中癌基因ras的活化机制是相同或相似的。因此利用这个模型可能进行人类癌变的体内分子遗传学研究和分子病理学研究。