法律和社会问题

转基因技术在最近几年中的另外一个重要进展是探索在实验室中构建新的生命体的可能性。转基因操作通常先从一个物种的基因组中分离出结构与功能已知的目标基因，如一种特定酶的编码基因或一组与特定生产性状相关的基因，再借助物理、化学或生物学方法的介导转移、整合于另一个物种的基因组，并使之表达与目标基因相关的性状。一般情况下，无论对转基因的供体物种还是受体物种而言，被转移的基因或基因群在基因组中所占的比例是极小的。所以，受体物种通常不会因接受了别的物种的一个或几个基因而从根本上改变物种的生物学属性，只是成了能表达新性状的一个新品种。然而，多年来科学家一直试图通过大规模的工程化设计和遗传操作，将不同来源的基因或大的基因组板块，甚至人工合成的DNA序列组合拼接在一起，组装成有功能的基因组，创造全新的生命体，这就是快速兴起的合成生物学。合成生物学家试图通过设计千变万化且带有标准化连接元件的DNA片段来创造、编写出一种全新的语言。每一个DNA片段或若干DNA片段的组合都代表某种特定的生物学结构信息或调节信息，组合在一起便能在适当的细胞环境中指导执行预设的生物学功能，成为有生命活力，且能复制繁殖的活细胞。随着DNA语汇的增加和编辑能力的提升，合成生物学获得了长足的进步。合成生物学涉及的学科领域除了分子生物学、生物化学和基因工程学外，还包括生物信息学、系统生物学、理论物理学、工程物理学、纳米材料科学和计算机模拟等学科，合成生物学使我们更为深刻、更为全面地了解生命，它的发展可能惠及农业、林业、畜牧业、能源、环境、医学、药学和精细制造工艺等人类社会生活的诸多领域。

脊髓灰质炎病毒（poliovirus）是小儿麻痹症的病原体，也是已知的能独立复制的最小的生物之一，它的遗传物质是一个长度约为7.5 kb的单链RNA分子。早在1981年科学家就弄清楚了脊髓灰质炎病毒的基因组序列和基因图谱，并查明了介导它感染寄主细胞的受体蛋白是CD155。1985年霍格尔（J.M.Hogle）等解析了这个病毒的三维结构。2002年，美国纽约州立大学石溪分校的塞洛（J.Cello）等在没有天然分子作样板的条件下，用化学方法成功地合成了脊髓灰质炎病毒基因组的互补DNA（cDNA），然后经RNA多聚酶催化转录出病毒RNA，再在无细胞提取液中使病毒RNA编码合成病毒蛋白质，组装成病毒样颗粒。这种由人工合成的脊髓灰质炎病毒样颗粒能感染表达人CD 155蛋白的转基因小鼠。塞洛等的实验是在全基因组水平上进行遗传操作的一个范例，为人造生命研究迈出了重要的一步。

设在美国马里兰州的，以科学家兼企业家文特尔（C.Venter）名字命名的生物能源研究所，在长期工作的基础上建立了多个基因快速重组和转移的整套技术，使合成新的生命形态的实验发展为一种制造工艺。应用这套工艺可以在一次实验中设计、合成和转移成百上千个基因，最终可能创造出类似细菌染色体的人工基因组。当然，要使人工基因组发挥作用还应该造就一个使基因组的功能得以表达和不断自我更新的生化环境，即有一个类细胞质膜包裹的、能进行物质和能量代谢，以及遗传信息复制和表达的生命微环境。

2007年，文特尔研究所的研究人员以丝状支原体（Mycoplasma mycoides）和山羊支原体（Mycoplasma　capricolum）为材料，首次成功地实现了一个物种的全基因组向另一个物种细胞质的移植，并使移植体在基因组和蛋白质组水平呈现与基因组供体物种完全一样的特征。研究人员在实验进行前就将四环素抗性基因TetM和半乳糖糖苷酶基因LacZ整合于生长速度快、形成菌落大而基因组总长仅1.08 Mb的丝状支原体LC菌株的基因组，作为基因组移植（genome transplantation）中供体基因组的选择性标记和显示性标记。实验者用温和、精细的操作流程分离供体基因组DNA，并小心去除蛋白质、脂质、RNA和在实验中断裂为线状的DNA残片，得到了完整的纯净的环状DNA分子作为移植供体（donor）。然后，将供体DNA分子与作为移植受体（recipient）的山羊支原体细胞共培养于含选择剂四环素和使菌体显示蓝色的显示剂x-gal的培养基中，做聚乙二醇介导的全基因组移植实验。两者共培养一定时间后，在培养基上挑选呈现供体物种特征的蓝色抗四环素大菌落，作为基因组移植体（genome transplants）的候选菌株进行鉴定分析，整个实验过程的每一步都设置了严格的对照组。

基因组移植体的鉴定是全面而系统的，主要包括物种特异性基因序列的分子杂交、全基因组限制性酶切片段的印迹分型、物种特异性抗原蛋白质的免疫检测和蛋白质组双相电泳图谱的高分辨率质谱分析等。结果表明，所有的基因组移植体候选菌株在基因组和蛋白质组水平无例外地都呈现与供体物种完全一样的特征。全基因组移植的过程很可能是在移植后的一个短时间内，受体细胞质内同时存在供体和受体的基因组，但随着细胞分裂和选择压力的增强，受体基因组逐渐被筛除。尽管确切的移植机制尚不清楚，但移植的结果与哺乳动物体细胞核向去核卵质移植的克隆实验几乎是一模一样的，即基因组移植体和克隆动物都呈现出遗传物质供体的全部特征。这套实验证实受体细胞质能为外来基因组的增殖复制和功能表达提供必要的，也是充分的条件。这是一项开创性研究，表明我们已经有可能在一次试验中将一个物种变为另一个物种。基因组移植为创造人工合成的生命体提供了生物学意义上的物质与能量平台。

2008年，文特尔等利用啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞将25个长度介于17～35 kb，且携带了重叠序列“榫头”的DNA片段组装成全长为590 011 bp的生殖支原体（Mycoplasmagenitalium）基因组JCVI-1-1。这项研究的突破在于将酵母细胞作为生物合成的遗传学工厂，而在此以前的人工基因组合成都是在原核生物细胞中完成的，真核生物细胞的应用明显提高了合成生物学的效率和适用范围。

2010年，文特尔团队在酵母细胞中，分三步将1 078个携带了重叠序列的DNA片段逐步合成丝状支原体全序列基因组，还插入了特定的分子序列，以及缺失和多态等标记性修饰，最终设计合成了全长为1 077 947 bp的基因组。然后，转入并完全替代了山羊支原体细胞的基因组，通过实验创造了一种名为实验室支原体（Mycoplasma　laboratorium）的新菌株，它与自然界的细菌一样能表达各种性状和复制增殖，但是一系列修饰标记表明它确实是人工合成的新菌种。

2014年，由约翰·霍普金斯大学的伯克领衔的一个包括美国、英国、法国、中国和印度等国科学家组成的科学小组在《科学》（Science）杂志上发表文章，宣布在经历了长达7年的研究后成功地合成了第一条能行使正常功能的染色体。这条人工合成染色体是参照长度为316 617个碱基对的啤酒酵母3号染色体的基本序列合成的，但进行了500多处人为修饰，删除了大段被认为是冗余的染色体片段，被删除的序列约占整个染色体的15%，其中包括没有已知功能的重复DNA和转座子、内含子、额外多余的转运RNA基因，以及决定酵母交配性别的基因（失去决定交配基因MATa会大大增加交配型a细胞的数量），可以说这个合成染色体基本上是没有“垃圾DNA”的。携带了这个合成染色体的酵母细胞与正常酵母细胞是难以区分的。同时也引入了许多微妙的序列改变，包括终止密码子TAG/ TAA间的置换，亚端粒区（subtelomeric region）、内含子、转移RNA和沉默配对位点（silent mating loci）、重复序列等的缺失，并插入了多个便于对染色体进行结构修饰的loxPsym位点（图9-15）。这条合成染色体总长为272 871个碱基对，取名为syn Ⅲ。synⅢ在啤酒酵母中能正常行使功能，也能正常复制。

图9-14　在酵母细胞中组装合成生殖支原体的基因组JCVI-1-1（引自D.G.Gibs。n等）

图中蓝色箭头代表用化学方法合成的、长度不等的DNA片段，褐色和黄色圆圈分别代表酵母细胞和细胞核，红色三角形代表载体序列。

图9-15中loxPsym是对称型loxP位点（symmetrical loxP sites）的缩写，它缺乏典型的loxP位点的结构方向性，因此可以有两个插入方向，预测其造成倒置和缺失的机会相等，所以可以和被诱导产生的Cre重组酶组成SCRaMbLE工具包的分子基础。SCRaMbLE（synthetic choomosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution）则是通过loxP介导的合成染色体重组和修饰导致演化的缩写。

图9-15　显示了每一个被修饰部位的人工合成的酵母染色体syn Ⅲ的示意（改自L.Reading-Ilkanada）

Cre（causes recombination）重组酶是源自噬菌体P1的一种特异性重组酶，能专一性介导两个loxP（locus of crossover P 1）序列之间的特异性重组。loxP长度为34 bp，由两个13 bp的重复序列和夹在中间的8 bp间隔序列组成，loxP的方向决定于中间的8 bp间隔序列。改变间隔序列的方向就可改变Cre酶的重组切割方向，而loxPsym的间隔序列是对称的使Cre酶对loxP序列的切割可能有两个概率相等的、呈现动态平衡的重组方向。

尽管人工合成的染色体syn Ⅲ只占整个酵母基因组的2.5%，但是酵母是具有复杂的细胞结构的真核生物，合成酵母染色体远比合成细菌的基因组困难。具有正常生物学功能的人工合成染色体syn Ⅲ的合成标志着构建完整的真核生物细胞基因组的历史阶段已经开始，有人预测在4年内有可能合成包括16条染色体的酵母全基因组，当然不一定以16条染色体格局来合成。可以预料培育能合成稀有贵重药物、疫苗、生物燃料或能降解环境污染物等特异生产性状的酵母新菌种的进度将大大加快，这将为基础医学、临床医学、预防医学、药学，以及工业生物技术提供革命性变革的新动力，无疑是合成生物学发展的一个里程碑，这也标志着合成生物学从理论到现实的转变。有人甚至把合成synⅢ时将总长273 871个核苷酸以正确的序列一个个连接成酵母基因，同时又删除了大量被认为是冗余的重复序列或含有跳跃基因的序列，加上一系列缺失、插入、替换等结构修饰，几乎在316 617个碱基对中变动了约50 000个碱基对的漫长而艰辛的过程比喻为攀登珠穆朗玛峰。

多年来遗传学家已经确定在酵母的大约6 000个基因中只有1 000个基因对其生存是重要的，删除其余5 000个基因中的任何一个都不会产生重大影响，不过同时删除两个属于同一个信号传递网络的基因，就会影响其生存。为此，研究人员企图在他们合成染色体上的每一个非必需基因两侧装上便于进行删除的标志性结构元件loxPsym，以便于观察和检验被改变或被删除的基因是否会影响酵母的存活。然而，这样做不仅工作量极大，还要冒大段DNA丢失，甚至细胞死亡的风险。研究小组的另一个选择是改变终止密码，将TAG变为TAA。如果能把其他染色体上的所有TAG都改变为TAA，这样就有可能让TAG在全新的合成酵母细胞中编码自然的酵母细胞不会编码的新氨基酸。特别是syn Ⅲ中大量插入的loxPsym，为深入分析或改变染色体结构与功能提供无限的可能性。

除了从头合成生物基因组之外，合成生物学的另一个重要研究方向是组合生物中已知的结构元件来提高代谢效率。2014年，英国埃克塞特大学（Universityof Exeter）的斯米尔诺夫（N.Smirnoff）课题组将参与特定的代谢过程的一系列酶，通过分子支架组装成一个由序贯代谢酶与相关细胞结构组分形成的超分子复合物——合成代谢体（synthetic metabolism）。合成代谢体能增加细胞局部中间代谢物的浓度和流量，引导反应产物流向特异的亚细胞位置，以及减少有活性的中间代谢物的漏逸，从而降低维持给定代谢速率所需要的酶的数量，大大提高蛋白质、核酸和其他生物活性物质的合成代谢效率。

最近，美国哈佛大学的西尔弗（P.Silver）将大肠杆菌噬菌体λ的cl/Cro调控系统的元件组合（参见第4章§ 4.4节相关内容）引入从小鼠肠道分离到的一株大肠杆菌中。这株经工程化改造的细菌在体外培养时，插入大肠杆菌的λ噬菌体会表达阻遏蛋白cl，一旦接触失去抗菌活性的去水四环素（anhydrotetracycline），就会表达阻遏cl的抗阻遏蛋白Cro。让小鼠口服这株工程菌，小鼠的粪便样本分析证实这株细菌已在小鼠肠道中生长增殖，并持续表达阻遏蛋白cl。当喂饲小鼠去水四环素后，从粪便样本中采集到的大肠杆菌中的λ噬菌体就会表达抗阻遏蛋白Cro。研究表明确实有可能在非常复杂的哺乳动物体内建立检测由环境进入体内的特定化学物的稳定的遗传报告系统。

当然，合成生物学在快速发展过程中也遇到了前所未有的挑战。首先，随着工作网络越来越大，其可调控的难度和生物合成所需的调控元件数量会成倍地增加。不仅元件的数量会急剧增加，对各种元件的技术鉴定也更加严格，因为插入未经严格鉴定的元件必然会增加反应的不确定性。其次，我们对生物系统的复杂性和能动性了解还存在很大的局限性，特别是对代谢过程精细调控的知识缺乏已经成为限制发展的瓶颈。此外，还必须考虑在特定微环境中所选用的不同元件之间的契合程度。最后一点，也是难度最大的问题是生物系统内在的可变性带来的不规则变动，即所谓的生物反应中的“噪声”。这种噪声造成的变异可能成为自然选择的重要基础，但是在人工合成的生物系统中就成了难以捉摸、难以控制的大问题。然而，我们可以相信合成生物学发展的势头是不可阻挡的。

可以设想，人工生命体的创造技术会给我们提供干预自然，甚至干预社会的新途径。我们可以根据特殊的需要来设计和构建能消除废气污染、净化江河湖海或产生生物能源的新型微生物，也可以针对肿瘤或其他难治的疾病来设计和构建治疗性“细菌”或“病毒”。毫无疑问，这是一项有着巨大经济和社会效益的新型技术。然而，一旦使用不当，就可能引发严重的伦理、法律和社会问题，甚至有可能变成人类社会面临的一种威慑力极大的风险，例如，研制出大杀伤力新型生物武器的潜在可能性会大大增加，或者会在某一天出现威胁人类生存的奇异的新生命形态，等等。因此，我们必须防范新合成的生命体从实验室逃逸到环境中去，我们要制定和强制执行对生物工程生命体及其基因的无序散布的管控。必须清醒地认识到合成生物学或人造生命技术有可能被用于生物恐怖主义，所以有必要同步发展相应的反制措施。我们要明晰相关技术和平台的所有权、控制权，谨慎处理相关专利的授权和市场调控。为了免受这项技术滥用可能带来的风险和灾难，我们有责任及早把这些问题放进议事日程并告知公众。

从生物演化的时间尺度看，自然界中生物物种内的不同群体之间和不同物种之间的基因交流从来没有停止过，它是生物基因组演化的一种基本机制。所以，物种的遗传完整性，或者讲基因组的稳定性是相对的，而不是绝对的。从某种意义上讲，转基因技术只是人为地扩大了物种内和物种间基因交流的规模，加快基因交流的速度。加上基于体细胞核移植的克隆技术，使得新的种群、新的物种的设计和构建成为实验室中的一项常规技术。毫无疑问，对于实验室中生成的新物种的环境释放，必须进行环境伦理学评估。

人类在地球上的存在已经超过了100万年，我们现在看到的地球生态环境，实际上并非纯自然的原生态，而是人类与自然长期相互作用的产物。人类社会的物质文明都是以人类对自然的干预为前提的。从远古时代起，人类一直在创造和应用种种选育方法来驯化和培植能满足人类自身的物质和精神需要的动植物品种。在长时期且强有力的人工选择压力下，各种农作物、家畜、家禽、花卉、牧草和宠物等的生物品种经历了各种的基因突变、染色体畸变和基因组结构重排，它们的遗传结构和表型特征与其野生祖先物种之间出现了质的歧异，这在某种程度上已经超越了自然与非自然的界限。工程化遗传修饰技术只是使人类对这个演化过程的干预更快、更强、更有效，是人类社会的科学与技术发展到现阶段所出现的一种改变人类物质文明的新武器。与核武器一样，生物基因组修饰和改造技术也是一柄双刃剑，必须审慎使用，严密控制，不仅应该做严格的科学评估，更要从伦理、法律和社会角度做全面评估。

遗传学也许是20世纪发展最快速、变化最剧烈的学科。从当年孟德尔的经典论文被埋没35年，到今天媒体和公众对人类基因组计划和转基因食品的热切关注，真让人有沧桑之叹，更不用说其间的政治和社会风波了。

在遗传学发展的历程中，科学概念的更新和实验技术的突破，以及两者的结合，不断深化我们对生物遗传和变异规律的认识，也不断增强我们用这些规律造福人类的能力。建立在对基因作用分子机制的认识和DNA结构修饰基础上的逆向遗传学则是概念更新和技术突破的又一个崭新的结合点。

从孟德尔算起，100多年来人类对遗传和变异现象的研究经历了多么曲折的道路，人们关于遗传物质结构和功能表达的认识，经历了一次又一次的升华。然而，这条曲折的路还在延伸，概念的升华必然还会多次发生，正是在曲折和升华之中，人类增强了对自然的把握和改造能力。1998年在北京举行的第18届国际遗传学大会上，著名遗传学家谈家桢（C.C.Tan）教授作为大会名誉主席提出将“遗传学造福全人类”（Genetics，Better For All）作为会议的宗旨，毫无疑问，这也宣示了遗传学要为全人类服务这个根本宗旨。