三级种制作技术

一、母种制作

母种即一级种，母种多用试管作为容器，因此又称试管种，是指经组织分离、孢子分离或基内菌丝分离而得到的菌丝体。母种培养基常用于菌种的分离、纯化、扩大、转管和菌种保藏。母种的制作过程可分为培养基的制作、灭菌和接种培养三个主要阶段。

（一）培养基配方

母种培养基的配方有许多，最常用的是马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基）和马铃薯综合培养基（CPDA培养基）。此外，各地的科研工作者和有经验的生产人员通过不断摸索设计出许多培养基配方（表1-4），生产者可根据具体情况酌情选择。

小知识

培养基是指根据食用菌生长发育需要配制而成的营养基质。培养基对于食用菌就如同食物对于人类一样重要，所以培养基的制作技术是食用菌栽培中必须掌握的一项基本技术。

表1-4 常见母种培养基配方

备注：上述配方中马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18～20g，水1000ml，pH自然；加富PDA培养基2中加入100g新鲜平菇子实体，加富PDA培养基3中加入100g新鲜香菇子实体。

（二）制作方法

以加富PDA培养基的制作为例，工艺流程见图1-14。

图1-14 加富PDA培养基的制作工艺流程

做一做

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（一）食用菌母种的制作

通过亲自操作，使农民朋友们掌握培养基的制作、灭菌、母种移接等操作技术和方法。母种接种：母种转管技术（图1-15）。

图1-15 母种转管操作

1.右手握接种器，靠烧灼灭菌，左手握平菌种管和待接试管；2.移取菌种；3.将移取的菌种块转接到待接试管中；4.塞好棉塞

母种的转接，也称转管、母种的扩大或继代培养。由于分离或引进的原始母种数量有限，不能满足生产所需，因此需要进行母种的转接。通常原始母种允许扩大转接3～4次，均称继代母种，用于繁殖原种和栽培种。

小知识

母种接种法：一般采用火焰封口接种法。先把斜面培养基及用具放入已灭菌的接种箱（室）内，用甲醛、高锰酸钾熏蒸40min消毒，双手用75%酒精棉球擦拭，然后开始接种。接种时，用接种钩取一小块菌种，接种于斜面培养基的中央，接种时，试管口必须置于火焰上方的无菌区。一般每管菌种可转接30支。接种后进行培养，根据不同的菌种类型控制不同的培养温度。

母种制作需要的材料：灭菌锅、接种箱或接种室、电热恒温培养箱、玻璃漏斗、漏斗架、止水夹、铝锅、电炉、1000ml量杯、纱布、棉花、18mm×180mm试管、细线绳、防潮纸或牛皮纸、刀、马铃薯、葡萄糖或蔗糖、琼脂、2cm厚长形木条、pH试纸、1mol／LNaOH溶液、1mol／LHCl溶液、酒精灯、75%酒精消毒瓶、75%酒精消毒棉球、接种针、火柴、记号笔。

（二）培养基的制作

为了获得优良和生长旺盛的母种，母种培养基的成分应选用营养丰富，容易被菌丝吸收利用的原料来进行配制。由于不同菌类对营养物质的需求不同，所以不同母种培养基的成分和比例也各有差异。

母种制作内容与方法步骤：

1.常用配方

（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂18～20g，水1000ml，pH值自然。

（2）马铃薯综合培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B110mg，琼脂18～20g，水1000ml，pH值自然。

上述两种培养基适用于培养绝大多数食用菌的母种。

2.配制方法

（1）先将马铃薯洗净，去皮，挖掉芽眼，称取200g，切成1cm见方的小块或薄片。

（2）将切好的马铃薯块放入铝锅内或大烧杯中，加水1000ml，放在电炉上煮沸后维持15～20min，至马铃薯熟而不烂。

（3）用4层湿纱布（纱布需浸水后拧干）过滤，由于马铃薯在煮沸过程中，有部分水被蒸发掉，所以过滤后的马铃薯汁应加水补足水分至1000ml。

（4）将称好的琼脂加入马铃薯汁中，在电炉上用文火煮，直至琼脂完全融化为止（边煮边搅拌）。最后加入葡萄糖等可溶性物质，搅匀。

（5）调节pH值。培养基中的酸碱度（即pH值）是影响菌丝生长的重要因素，因此培养基配好后应根据菌种对pH值的要求进行调节。马铃薯葡萄糖琼脂培养基配好后pH一般为中性，所以不必调节。如培养基低于所要求的pH值时，应向培养基中滴加1mol／L的NaOH溶液；若培养基高于所要求的pH值，应滴加1mol／L的HCl溶液进行调节。边滴入，边搅拌，边用精密pH试纸或pH计测定，直至合适为止。应该注意的是灭菌前培养基的pH值不宜调至6.0以下，否则灭菌后培养基不凝固。有些菇类的培养基要求在pH值6.0以下时，要待灭菌后在无菌条件下滴加盐酸或乳酸等进行调节。

（6）加水至1000ml。

（7）分装试管。培养基配好后应趁热用漏斗分装试管，装入试管高度的1／5～1／4，分装时应注意不得使培养基沾在试管的口壁上，以防杂菌污染。

（8）塞棉塞。培养基分装完以后应立即塞上大小合适的棉塞或透气的胶塞。棉塞或胶塞应塞入试管内2／3，外留1／3。

（9）扎把。将塞好棉塞的试管7或9支扎成一把，在棉塞外面包一层防潮纸或牛皮纸，再用线绳扎紧，防止灭菌时棉塞被冷凝水浸湿。

（三）灭菌

培养基分装后应立即灭菌。根据培养基的成分选择灭菌的压强和时间，一般马铃薯葡萄糖琼脂培养基采用1.05～1.1kg／cm2的压强，灭菌20～30min。

母种培养基的灭菌常用手提式灭菌锅，其使用方法如下：

（1）先在外锅加入适量的水，然后将灭菌物品直立放入内锅，试管口向上且不要贴锅边，避免冷凝水浸入试管。灭菌物品不要装得太满，留出一定空间。便于蒸汽流通，否则易造成灭菌不彻底。

（2）盖上锅盖，盖锅盖时应将锅盖上的排气管插入锅内壁的管孔内，然后按对角线方向拧紧锅盖上的螺丝，并将放气阀直立打开，安全阀横向关闭。

（3）将灭菌锅放在电炉上加热，当锅内蒸汽大量排出时再继续排气3～5min，关闭放气阀。

（4）当压力表指针达到1.05kg／cm2时（灭菌所需压强）开始计时，继续维持该压强20～30min。灭菌结束待压力表指针自然回到“0”位时打开放气阀，排出锅内剩余蒸汽后，打开锅盖。注意切忌在压力表未到“0”位时就放气，以免试管内的培养基向上冲，浸湿棉塞，造成以后菌种的污染。

提个醒

注意：切记灭菌结束待压力表指针自然回到“0”位时打开放气阀。

（5）摆斜面。试管取出后一定要趁热摆斜面，将试管斜放在一根厚2cm左右的木条上，使试管内的培养基成一斜面。斜面的长度一般为试管长度的3／5。用于保藏菌种的试管斜面应适当短些，以减少蒸发面积。气温较低时，在摆好的斜面上面覆盖一条厚毛巾，以免在试管壁上产生大量水珠，影响接种和培养。当培养基冷凝后，即可收起备用。

（四）接种和培养

将斜面培养基放进接种室、接种箱或超净工作台内，用紫外灯（或化学药品如甲醛等）消毒0.5h以上，关闭紫外灯后才能进入接种室内接种。接种是一项技术性很强的工作，需要在洁净的环境中以无菌操作方法进行接种，才能减少污染。无菌操作是接种过程中最基本的操作方法，要求操作熟练，动作迅速。正确的接种方法是：

（1）左手平托两支试管，手指按住试管底部，外侧一支是供接种用的菌种试管，内侧一支是待接母种的试管，见图1-16。

（2）右手拿接种针或接种铲，用拇指、食指和中指握住其柄部，将接种针或接种铲插入75%的酒精消毒瓶中消毒，在酒精灯火焰上灼烧接种针或接种铲的顶端，逐渐将杆部也在火焰上慢慢通过，这样反复三次即可将接种针或接种铲彻底灭菌，切记最后一次灼烧后不能再浸入酒精瓶中，应在火焰旁自然冷却。

（3）将左手平托的两支试管管口靠近火焰，用右手的小指和手掌将外侧的菌种管上的棉塞拔出，再用中指和无名指拔出内侧试管口上的棉塞，将其夹在手中（不得放在桌子上或台面上），把两支试管口迅速移到酒精灯火焰旁边。

（4）将烧过并冷却的接种针或接种铲伸入母种试管中，在菌丝斜面上勾取火柴头大小的一块菌丝块，迅速放到待接试管斜面的中部，将试管口在火焰上烧一下，然后立即塞上棉塞。

（5）接种完毕，再将接种针或接种铲在火焰上灼烧灭菌，以免使接种的菌丝扩散，造成污染。

（6）菌种接完后，贴好标签或用记号笔在试管壁上注明菌种名称及接种日期等。

图1-16 接种操作

（7）将同类菌种扎好，送到该菌所要求的最适宜温度下（恒温箱或恒温室内）培养。一般培养2天，检查有无杂菌生长，7～10天母种菌丝即可长满斜面。

通过培养，在试管斜面上长出洁白、粗壮的菌丝体，说明接种成功。若在试管斜面上出现有光泽、黏液状培养物或呈黄、绿、灰、黑等毛状物时，即被污染，不能使用。

小知识

优良菌种的感观应具备“纯、正、壮、润、香”的特点。“纯”指菌种的纯度高，无感染杂菌，无斑块，无抑制线，无“退菌、断菌”现象；“正”指菌丝生长无异常，具有亲本正宗的特点；“壮”指菌丝发育粗壮，长势旺盛，有力；“润”指菌种含水量适中，无干缩、松散现象；“香”指具有品种特有的香味，无异味。

二、原种、栽培种培养基制作

（一）培养基配方

原种和栽培种的配方分粮粒类（谷物）培养基（表1-5）和代料培养基，且配方很多，这里介绍几种草腐生型和木腐生型的常用配方，见表1-6。

表1-5 谷物培养基配方（%）

备注：用煮小麦的水拌料木屑效果更好。

表1-6 草腐生型、木腐生型常用配方（%）

续表

备注：上述配方中加入过磷酸钙1%～1.5%，蔗糖0.5%，尿素0.5%，磷酸二氢钾0.2%；配方1适合香菇、黑木耳、平菇原种生长，菌丝粗壮、洁白；配方2适合培养平菇原种，菌丝生长速度快，且菌丝粗壮；配方3适合培养平菇原种，菌丝生长健壮；配方4、配方5适合大多数品种；配方6适合草腐生品种。

（二）制作方法

1.工艺流程 原种和栽培种扩繁工艺流程见图1-17。

图1-17 原种和栽培种扩繁工艺流程

草腐生型、木腐生型培养基制作工艺流程见图1-18。

图1-18 草腐生型、木腐型培养基制作工艺流程

2.制作方法 草腐生型和木腐生型原种、栽培种培养基制作：

（1）拌料。干混（将主料和辅料混匀）；湿混（将石灰等微溶和溶于水的辅料制成母液，加入所需水量，稀释后搅匀拌料）。

（2）装瓶。闷1～2h（夏季时间不宜过长），待培养料充分吸水后装料（原种、栽培种可以使用500ml或750ml罐头瓶，栽培种一般使用17cm×35cm× 0.005cm的筒袋或折角袋）至瓶肩处，培养料做到上紧下松，擦干净瓶口内外侧，打0.5cm粗接种孔至瓶底，用双层封口膜封口（原种分别用带接种孔的封口膜，即普通封口膜剪边长1.5cm菱形口和普通封口膜封口；栽培种筒袋一般两端直接扎绳，留够接种的长度；折角袋一般直接使用专用的塑料套环和塑料盖，塑料袋栽培种填料做到松紧适度，料袋不打折，用手触摸袋壁挺实不塌陷。

（3）灭菌。高压灭菌于126℃左右维持2h；常压灭菌于100℃维持10～12h，夏季时间可酌情延长。栽培种袋灭菌最好使用周转框，以保证灭菌效果。

（4）出锅、冷却。出锅后置于接种室或接种帐内冷却，准备使用。

做一做

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棉子壳原种的制作

（1）配方：棉子壳78%，麦麸或米糠20%，石膏1%，蔗糖1%。

（2）拌料：先根据要做原种的数量，算出各种原料的用量。然后称量，混合，加水拌料。混合时，先将棉子壳和麦麸混合在一起，石膏和糖混溶在拌料用的水中。拌料时，边加水，边搅拌，边测试含水量。

（3）含水量的测定：拌好料后，用手抓一把培养料，攥紧，手指缝中有水印但以水不下滴为适，此时含水量60%～62%。

（4）装瓶：将拌好的培养料装入原种瓶或塑料袋中，边装边压实（但不得过紧），装到瓶肩处为宜。

（5）打孔：装好培养料以后，用锥形木棒从瓶或塑料袋中央向下打一个洞，洞深距底部2～3cm。这样可使下部培养料通气良好，有利于接种后菌丝迅速向培养料中蔓延。

（6）擦瓶：将瓶口和瓶外黏附的培养料擦掉，以免接种后被杂菌污染。

（7）封口：用棉塞或聚丙烯塑料薄膜封口，再绑一层防潮纸（或牛皮纸）。用线绳将瓶口扎好，准备灭菌。

（8）灭菌：灭菌方法同母种的灭菌方法，压强为1.4～1.5kg／cm2，灭菌1.5～2h。

（三）原种质量检查

接种后在25℃左右培养20～40天，菌种即可长满瓶。品质优良的原种，菌丝洁白、纯净，有食用菌特有的香味。若出现黄、绿、黑等颜色的毛状物或菌瓶内有酸、臭味道，即是污染了杂菌，不能使用，应将其灭菌后在远离培养场地处深埋。

算一算

若需9月10日栽培平菇，投入1.8万棒，您选择什么品种？哪种培养基？何时进行原种接种？原种接种多少瓶？何时进行栽培种接种？请进行成本核算，对照当地的市场价格算一算投入产出比。

知识链接

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接种帐接种技术

1.接种前的准备工作

（1）白大褂用来苏尔最后清洗，选择洁净场所晾晒，搬运入棚，由地膜包裹。

（2）拖鞋用消毒药水浸沾后，放入棚内。

（3）酒精要求为医用酒精75%。

（4）刀片、打孔器、套袋、筐都要经过消毒处理后才能进入接种帐。

（5）接种帐吊挂，罩严菌垛，用菌棒把地脚压实。检查各处，不能有孔洞。接种帐的材料为聚乙烯膜，帐内空间为长10m，宽4m，高度根据工作人员身高而定，以不妨碍工作人员工作为宜。

（6）接种组为7个人，进帐前换工作服，戴口罩、帽子。

（7）菌种要认真选择无杂菌的种子，入棚前要用消毒剂进行浸泡。

2.接种前的消毒处理 接种前用必洁士进行消毒处理。

（1）时间在接种前6～10h，密闭消毒4～6h，开始放气，熏药容器放在垛顶（距地面高1.2m），采用6点布点法。

（2）用药量每次帐外1瓶，帐内2瓶。

（3）熏药前进入棚室要换工作服、工作帽和口罩。

（4）放气时将熏药容器带出帐外。

3.接种操作技术要领

（1）接种前换好工作服、鞋帽、口罩。

（2）集体一次进入帐内，先检查菌棒是否有污染。如果有，应采用酒精棉球消毒后套袋轻放于一角，待接种完毕后带出棚外。

（3）发现帐子有孔洞，污染度高时，要停止接种，追查原因。

（4）接种操作7人一组：1人打穴，3人接种，2人搬垛，1人处理菌种。进帐后，每人要用酒精擦手。工作过程中要不定期地用酒精棉球擦手。

（5）打穴人员要在棒上均匀打3个孔穴。期间经常用酒精擦一下打孔器尖端。

（6）接种人员每次取菌种时必须用棉球擦手。接种时做到快速准确，菌种大小适宜，不要捻碎菌种。发现有杂菌污染时要及时报告，停止使用，并用酒精消毒后放入套袋内，接种完成后带出棚外。

（7）要求搬垛人员把接种完毕的菌棒轻拿移放到适当位置，并码放整齐，不能倒垛。发现掉菌种时，要让接种人员补接。

（8）接种完毕后，盖好薄膜，压实。到接种帐打扫卫生。洗工作服。

4.接种注意事项

（1）接种时不准随意进出接种帐，一旦进入就要接完才能撤出。

（2）不准在帐内吃食物，喝水。

（3）不准留长指甲，戴戒指、耳环、项链等。

（4）不准随意掀起接种帐的底脚。

（5）不准在未接种的垛上迈步。

（6）盖薄膜时，垛底不准留下各种杂物，要保持垛内洁净。