基因多态性与肉质性状的关联分析

脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL），全称为三脂酰甘油蛋白脂酰基水解酶（triacylglyceroprotein acylhydrolase），它是水解酶家族（包括胰脂肪酶、肝脂肪酶等）的一种三酰甘油-蛋白酰基水解酶。LPL是影响体内脂肪分解代谢的重要因素之一，在新陈代谢、物质和能量循环方面有着特殊的效果。LPL主要位于脂肪细胞、血管和骨骼肌内，调控脂肪的代谢循环，为机体提供能量。LPL的含量差异可引起物质和能量代谢的变化，进而影响机体内的各种平衡与循环的维持与进行。

本研究通过对肉羊肉质性状有较大影响的LPL基因的结构与功能分析，探讨LPL基因多态性与肉羊肉质性状间的关联，为研究LPL基因及其编码氨基酸的结构与功能提供参考，也为改善肉羊肉质及其遗传资源的开发和利用提供遗传学基础。

1 ．LPL基因的研究进展

（1）脂肪的合成及分解过程

脂肪也常被称为甘油三酯（Triglyceride，TG），主要由甘油的三个羟基和三个脂肪酸缩合而成，是能量在机体内转化与累集的重要方式。肝、脂肪组织、小肠是脂肪合成的重要场所，以肝的合成能力最强，而脂肪细胞则是机体合成及储存脂肪的仓库。哺乳动物的肝脏与脂肪组织是脂肪合成并转运的主要场所，而活LPL能够加快脂肪分解代谢并受到乳糜微粒（CM）及极低密度脂蛋白（VLDL）的调控，脂肪分解后产生的单甘油酯（MG）和游离脂肪酸（FFA）也会被转移到细胞内利用或继续降解，产生大量能量与新陈代谢的原料，被机体吸收后进行新的合成利用。脂肪的合成和分解过程在体内时刻不停地进行，而体内脂肪含量的升高或降低要受到这两种新陈代谢过程的速度差异影响。

由NADPH提供能量、于脂肪酸合成酶复合体系中进行脂肪的合成。而脂肪的分解是指脂肪分解为甘油和脂肪酸并被转运到其他组织与细胞中进行代谢利用。脂肪在血液中一般都是以脂蛋白形式运输，会受到脂蛋白脂酶LPL含量的调节。因此LPL的活性就可视为脂肪储集程度的一种指标，它调节着动物体内脂肪的储集与代谢。

（2）脂蛋白脂酶的结构与功能

脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase， LPL），全称为三脂酰甘油蛋白脂酰基水解酶（triacylglyceroprotein acylhydrolase），它是水解酶家族（包括胰脂肪酶、肝脂肪酶等）的一种三酰甘油-蛋白酰基水解酶，其总分子量为50至70 KD。LPL是影响体内脂肪分解代谢的重要因素之一，在新陈代谢、物质和能量循环方面有着特殊的效果。LPL主要位于脂肪细胞、血管和骨骼肌内，调控脂肪的代谢循环，为机体提供能量。LPL的含量差异可引起物质和能量代谢的变化，进而影响机体内的各种平衡与循环的维持与进行。LPL是一种调节脂肪分解代谢的限速酶，遍布与脂肪有关的组织及细胞，催化了脂蛋白间的物质交换。另外，甘油三酯还能在胆固醇酯转运蛋白的影响下代替部分其他脂类起作用。

脂蛋白脂酶的活性主要受营养因素和激素水平等的调节。具有生物活性的LPL呈二聚体形式，能通过静电引力和毛细血管内皮细胞表面上的多聚糖进行结合，而肝素可以促进此种结合形式的LPL释放进入血液，并提高其活性。当二聚体分离时则脂解甘油三酯的活性会发生进行性丧失。在对LPL的空间结构进行研究发现至少有6个功能区及结构域，且主要集中于中心部分：分泌位于细胞膜表面的由27个氨基酸所构成的信号肽；与载脂蛋白II的结合区；与脂蛋白类物质的结合位点；催化甘油三酯脂解区（人的LPL的Ser132-Asp156His241为催化活性三联体）；肝素的结合区；与另外一个LPL亚单位进行结合形成活性同源二聚体的位点。在各物种间LPL的氨基酸序列具有高度保守性，约有300多个氨基酸完全相同，说明LPL基因在生物进化的过程中并未发生较大的变化。

脂蛋白脂酶的在各组织中有着不一样的作用机理，存在特异性，目前人们普遍认为白色脂肪组织（WAT）中LPL的活性升高不利于脂肪的代谢，棕色脂肪组织（BAT）中机体的产热可能是受LPL影响，而骨骼肌内的于机体对能量的利用需要LPL的协助。LPL的缺乏与过多，都会使脂肪代谢发生显著的改变，导致机体内脂肪的过多沉积或大量分解，从而影响生物的各项生理指标。

（3）LPL基因的研究

LPL基因拥有着重要的功能性结构特征，其中含有N-连接糖基化位点，肝素与载脂蛋白（apo CⅡ）结合和活化位点及脂类结合与水解位点。载脂蛋白能作为脂蛋白脂酶的激活剂，而肝素则直接参与了LPL的作用。有多个物种的LPL氨基酸序列已经通过其c DNA的序列推导出来，而除了apo CⅡ这个结合位点外，其他的功能位点已通过共有序列推测定位出来。在不同物种的脂蛋白脂酶中，这些区域的结构是高度保守的。目前，科研人员已顺利检测并克隆了多种生物的LPL基因，进行了多次基因功能分析与染色体上位置的研究。Wion等在1987年就成功克隆出全长35kb的人类LPL基因，位于第8染色体的P22区，包括十个外显子与九个内含子。与人类相似，鸡的LPL基因也含有同样数目的外显子和内含子，全长17 kb，外显子和内含子之间通过GT-AG方式进行连接。Senda等（1987）研究了牛的LPL基因，并从牛奶中提纯得到了LPL，经研究发现发现了c DNA克隆序列中含有完整编码区及3’UTR。

在人类LPL基因研究方面，由于LPL过多或缺乏都会影响到脂肪的正常新陈代谢，常被作为影响着脂肪代谢的一种重要基因，被认为是与多种脂肪疾病关系密切的重要候选基因。人类LPL基因位于8q22，长约36 kb，包括10个外显子和9个内含子。编码含475个氨基酸残基的蛋白质，其中包括一条由27个氨基酸残基组成的信号肽，经过翻译修饰后，信号肽被切除，产生含448个氨基酸残基的成熟LPL分子。外显子1编码m RNA5’端不翻译区、信号肽和成熟蛋白质分子的前2个氨基酸残基；外显子2编码的序列包含Asn43糖基化位点；外显子4编码脂质结合区；外显子5编码活性位点；外显子6编码肝素结合区；外显子7、9编码载脂蛋白B（apolipoprotein B， apo B）结合位点；外显子8编码另一N端糖基化位点；外显子10长1948 bp；编码m RNA3’端不翻译区，与m RNA的稳定性有关；内含子中存在Alu重复序列和多态性位点，可能与基因转录调节、hn RNA的加工、DNA复制的启动有关。有关LPL基因的遗传变异研究已有许多，已发现的突变主要存在于外显子1-9，内含子2、3、6、8及启动子区域，至少存在9种无义突变与30种错义突变。外显子3、4、5、6是存在较多突变的区域，而第6内含子与第8内含子上存在的HindⅢ和PvuⅡ突变位点的多态性已引起了较多的研究。

在猪LPL基因研究方面，胡代奎等（1994）研究发现，在早期猪胚胎中LPL并无活性，而是在90日龄左右表现出来，且肥肉型猪体内LPL的活性显著高于瘦肉型。吴桢方（1999）对通城、梅山、大白及长白猪LPL基因进行了分析，在5’UTR区发现了突变位点，其中等位基因C对背膘厚的影响差异显著。雷明刚（2002）对大白猪、长白猪、杜洛克、通城猪、清平猪和大白×梅山F2代的LPL基因两个突变位点进行了SNPs分析，发现其中Mlu I位点基因型相同，无显著差异，而在第6内含子Sma I位点两种基因型的平均背膘厚存在显著差异。张振波（2005）对大白×梅山F2代的LPL基因c DNA序列进行测定并研究其内含子SNPs位点与部分性状的关联性。结果表明，内含子3上的Nhe I酶切位点AA，AB、BB三种基因型在眼肌高、皮率性状上存在显著性差异，且均表现为加性效应作用方式；内含子3上的Eco T22 I酶切位点处AA、BB基因型在6、7肋处膘厚、骨率、皮厚性状上存在显著性差异，且均以加性效应的作用为主。王文涛等（2009）使用PCR-RFLP技术，对大白猪、东北民猪、杜洛克和长白猪4个猪种的LPL基因的多态性进行了检测。结果表明LPL基因片段经Eco R I内切酶消化后获得3种基因型：AA型（1901 bp）、AB型（1901 bp/1 223 bp/678 bp）和BB型（1223 bp/678 bp），卡方检验结果表明各基因型的分布在各猪种间差异不显著。

在牛LPL基因研究方面，郭艳青（2007）通过PCR-SSCP技术对牛LPL基因进行了多态位点检测，发现牛LPL基因第2、5、6、8、9外显子及第l内含子上存在多态位点。王兴平等（2012）采用创造酶切位点的PCR-RFLP技术对湘西黄牛LPL基因第2外显子进行了SNPs检测，并分析了突变位点各基因型与湘西黄牛生长性状间的关联性。

在羊LPL基因研究方面，方鸿滨等（2010）利用RT-PCR方法成功克隆了金堂黑山羊的LPL基因序列，分析表明金堂黑山羊的LPL基因开放阅读框长1437 bp，共编码478个氨基酸，存在种间保守性和特异性。秦玉蓉等（2011）成功克隆徐淮山羊脂蛋白脂基因的c DNA，并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位。高思等（2011）利用RT-PCR和T-A克隆技术获得了藏绵羊LPL基因，并对其进行生物信息学分析。胡仕良（2012）克隆得到西农萨能羊LPL基因的c DNA序列并利用RT-q PCR技术测量了该基因在多个体组织中的表达情况，还研究了在LPL缺乏情况下羊体内脂肪的新陈代谢情况的变化。

2．试验材料

肌肉组织样本采集自吉林省农科院畜牧分院肉羊场饲养的同批48头8月龄，生长状况接近的健康东北肉羊，采样部位为后肢大腿部肌肉，将样品迅速分割为1 g左右的小块后于液氮中保存以备总RNA和DNA的提取。

3．实验方法

（1）东北肉羊LPL基因c DNA序列克隆及分析

①引物设计

登陆Gen Bank数据库，根据已公布的普通绵羊LPL基因m RNA序列（Gen Bank登录号：NM_001009394），并参考相关文献，使用Primer Premier 5.0软件设计LPL基因特异性引物，上游特异性引物为5'-AGGAAGCTTCGGCTCTACTGCTCTGTC-3'，下游特异性引物为5'-GAAGGATCCCTTTCTTCTGTAGCTTTGC-3'，预期扩增片段长度为1 530 bp。将设计好的引物序列送到上海生工生物工程公司合成，并配制成10 umol/L的试剂，于-20 ℃下保存备用。

②总RNA的提取（见第三章）

③ LPL基因c DNA第一链的合成

主要使用Transcriptor First Strand c DNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行合成。首先将所需试剂解冻并轻度离心后置于冰上，于冰上往1.5 m L离心管中加入1μL Anchored-oligo（d T）18 Primer，2μg总RNA，添加灭菌dd H2O至总体积13μL。65 ℃加热10 min后置于冰上冷却，再加入以下组分：5×RTBuffer 4μL，RNase Inhibitor 0.5μL，d NTP Mix 2μL，Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5μL。55 ℃孵育30 min后85 ℃加热5 min使酶失活，最后置于冰上终止反应。得到的c DNA可立即用于试验或于-20 ℃保存备用。

④ LPL基因c DNA PCR反应

于冰上配置以下PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，d NTP Mix 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，LPL基因 c DNA 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，dd H2O 16.8μL，总体积25.0μL。扩增条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环，72 ℃延伸5 min。

⑤ PCR产物的电泳检测

扩增结束后，取5μL PCR产物和1μL 6×Loading Buffer混匀后点样于1%琼脂糖凝胶中，并点6μL D2000 DNA Marker 作为参照物。使用1×TAE缓冲液，100 V电压进行电泳，25 min后将琼脂糖凝胶置于紫外灯下观测扩增结果并拍照记录。

⑥ PCR产物回收与纯化、连接、转化、阳性克隆鉴定与测序方法同第二章。

（2）LPL基因SNPs筛查

①引物设计

经过参考相关文献，选择LPL基因第3、4、5和6外显子进行扩增测序与SNPs筛查。根据已公布的普通绵羊LPL基因序列（Gen Bank登录号：NC_019459.1），使用Oligo 7.0软件设计LPL基因第3、4、5和6外显子特异性引物，引物详情如下表所示。将设计好的引物序列送到上海生工生物工程公司合成，并配制成10 umol/L的试剂，于-20 ℃下保存备用。

表11-1 外显子引物信息

②基因组DNA的提取、纯度与浓度检测

③ PCR反应

于冰上配置以下PCR反应体系：Premix Taq 12.5μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，总基因组DNA 1μL， dd H2O 10.7μL，总体积25.0μL。扩增条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，X ℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环，72 ℃延伸5min，4 ℃保存。退火温度X根据各外显子所用引物不同而加以调整。

PCR结束后，取5μL PCR产物和1μL 6×Loading Buffer混匀后点样于1%琼脂糖凝胶中，并点6μL D2000 DNA Marker 作为参照物。使用1×TAE缓冲液，100 V电压进行电泳，25 min后将琼脂糖凝胶置于紫外灯下观测扩增结果并拍照记录。

④测序与SNPs筛查

于LPL基因第3、4、5和6外显子PCR产物中各自随机挑选10份样品送往哈尔滨博仕生物公司进行测序。将测序结果使用DNAstar软件进行比对分析，寻找SNPs位点并记录。

⑤ SNPs位点的酶切与基因分型

根据各外显子序列比对分析结果，寻找可进行限制性内切酶酶切的位点，建立以下酶切体系：10×Buffer 2.0μL，PCR产物10.0μL，BSA 0.2μL，限制性内切酶（10 U/μL）0.5μL，dd H2O 7.3μL，总体积20.0μL。于37 ℃过夜消化后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，拍照记录并统计基因型。

（3）LPL基因多态性与肉质性状的关联分析

①群体遗传分析

分析指标主要包括基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡检验、基因纯合度（Ho）、基因杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）等，具体方法见第三章。

②主要性状关联分析

主要性状指标包括：p H1、滴水损失、压榨损失、熟肉率、嫩度、脂肪酸含量、氨基酸含量等。

根据影响肉羊肉质性状的因素并考虑到年龄和遗传效应，进行关联性分析时采用了以下固定模型：Y=μ+G+e，其中Y为肉质性状，μ为均值，G为基因型效应，e为随机误差。使用SPSS 20.0软件单因素方差分析中的Duncan法分析试验数据，对各基因型间肉质性状指标（平均值±标准差）进行差异显著性检验。

4．实验结果

（1）东北肉羊LPL基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

①总RNA的提取与鉴定

本试验主要使用Trizol试剂法从随机1份肌肉组织样本中提取总RNA，其1%琼脂糖凝胶电泳结果如图11-1所示，呈现28 S、18 S和5S三条亮带，条带完整，表明所提总RNA的完整性较好；以RNase-free dd H2O为对照，所提总RNA OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，表明总RNA的纯度较高，无杂质污染，可作为模板反转录LPL基因c DNA。

图11-1 总RNA凝胶电泳结果（M：Marker；1：总RNA）

② LPL基因c DNA PCR产物鉴定

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图11-2所示，可见条带位于1 000 bp至2 000 bp之间，根据设计应为1 530 bp，与预期结果相一致。

图11-2 PCR产物凝胶电泳结果（M：Marker；1：PCR产物）

③ LPL基因c DNA测序结果及分析

将阳性克隆送去测序，得到 LPL基因c DNA测序结果如图11-3所示，全长1530 bp，通过DNAstar软件中的Edit Seq程序进行分析后，发现其ORF（open reading frame，开放阅读框）区长1437 bp，以起始密码子ATG开始，终止密码子TGA结尾，共编码478个氨基酸。将东北肉羊LPL基因c DNA序列及编码氨基酸序列提交到NCBI数据库利用Blast程序与另外8种动物进行比对，结果如表11-2，11-3所示，东北肉羊与绵羊、山羊、牛、猪、猫、黑猩猩、人、鼠的LPL基因c DNA序列同源性分别为99.8%、98.9%、98.1%、91.3%、90.7%、88.9%、88.4%、85.1%，氨基酸同源性分别为100.0%、99.2%、99.4%、92.5%、91.4%、91.8%、91.6%、89.3%。由此，可确定该序列为东北肉羊LPL基因的c DNA序列。

图11-3 LPL基因c DNA测序结果

表11-2 东北肉羊与其他8种动物LPL基因c DNA序列多重比对（%）

表11-3 东北肉羊与其他8种动物LPL基因编码氨基酸序列多重比对（%）

④ LPL基因及编码氨基酸序列的系统进化树

使用DNAstar软件的Meg Align程序绘制系统进化树，如图11-4、11-5所示。LPL基因及氨基酸系统进化树表明，亲缘关系较近的物种遗传距离近，如东北肉羊与绵羊、山羊的遗传距离较近，与牛、猪、猫、人、黑猩猩、鼠的遗传距离较远。

图11-4 东北肉羊与其他8种动物LPL基因序列系统进化树

图11-5 东北肉羊与其他8种动物LPL基因编码氨基酸序列系统进化树

（2）LPL基因的多态性及其与肉质性状的关联性分析

①基因组DNA的提取与鉴定

48个样本的基因组DNA主要使用Axy Prep基因组DNA小量试剂盒进行提取，其经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图11-6所示，呈现一条完整的亮带，无拖尾现象，表明所提基因组DNA的完整性较好；以RNase-free dd H2O为对照，所提基因组DNA的OD260/OD280比值都在1.7以上，表明总RNA的纯度较高，无杂质污染，浓度在300 ng/μL左右，可直接进行PCR扩增。

图11-6 基因组DNA凝胶电泳结果

注：1~4：基因组DNA

② LPL基因遗传多态性分析

A. LPL基因第3-6外显子PCR扩增结果

根据已得到的东北肉羊LPL基因c DNA序列，与绵羊LPL基因序列进行比对，设计第3-6外显子引物。第3外显子PCR产物长度为335 bp，包括115 bp的第2内含子、180 bp的全部第3外显子和40 bp的第3内含子；第4外显子PCR产物长度为485 bp，包括314bp的第3内含子、112 bp的全部第4外显子和59 bp的第4内含子；第5外显子PCR产物长度为590 bp，包括78 bp的第4内含子、234 bp的全部第5外显子和278 bp的第5内含子；第6外显子PCR产物长度为550 bp，包括139 bp的第5内含子、243 bp的全部第6外显子和168 bp的第6内含子。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图11-7-11-10所示，条带完整明亮，处于预期位置。将所有PCR产物送往哈尔滨博仕生物公司进行测序。

图11-7 第3外显子PCR产物凝胶电泳结果

注：M：Marker；1-4：第3外显子PCR产物

图11-8 第4外显子PCR产物凝胶电泳结果

注：M：Marker；1-3：第4外显子PCR产物

图11-9 第5外显子PCR产物凝胶电泳结果

注：M：Marker；1-4：第5外显子PCR产物

图11-10 第6外显子PCR产物凝胶电泳结果

注：M：Marker；1-4：第6外显子PCR产物

② LPL基因SNP位点群体遗传学分析

将LPL基因第3、4、5和6外显子测序结果分别用DNAstar软件的Seq Man程序进行比对分析，共发现3个SNP位点，如图11-11所示：第3外显子46 bp处（羊LPL基因ORF 304 bp处）T/C，第3外显子126 bp处（羊LPL基因ORF 384 bp处）A/T，第4外显子24 bp处（羊LPL基因ORF 462 bp处）T/C。这3个SNP位点都没有引起氨基酸变异，属于同义突变。由于第1和第3个SNP位点没有找到合适的限制性内切酶进行酶切分型，而第2个SNP位点可被Pst I限制性内切酶识别，本试验将对此SNP位点进行酶切分型，并将其表述为A384T位点。

图11-11 LPL基因序列SNPs位点

③ LPL基因A384T位点RFLP基因分型

将48个样本的第3外显子PCR产物进行酶切分型后将产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图11-12所示，发现存在335 bp、（335+241+94）bp和（241+94）bp 3种基因型，可分表述为TT、TA和AA，其数量分别为2、12、34。

图11-12 LPL基因A384T位点Pst I酶切结果

注：M：Marker；1-5：酶切产物

④ LPL基因A384T位点的群体遗传特性

由表11-4可知，东北肉羊LPL基因A384T位点AA基因型频率最大，TT基因型频率最小，TA基因型则介于这二者之间，表明A为优势等位基因。由表11-5可知，该位点的多态信息含量为0.2392，结合其他数据表明东北肉羊群体在此位点处于低度多态（PIC＜0.25）。而Hardy-Weinberg平衡检验结果表明，在该位点东北肉羊群体已处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。

表11-4 LPL基因A384T位点基因频率和基因型频率

表11-5 LPL基因A384T位点群体遗传特征

⑤ LPL基因A384T位点多态性与肉质性状的关联性分析

东北肉羊LPL基因A384T位点三种基因型的肉质性状的平均值及标准差结果如表11-6所示，使用SPSS 20.0软件对其进行差异显著性检验，结果表明：TT型个体滴水损失极显著高于TA型和AA型个体（P＜0.01）；TT型个体p H1值显著高于TA型个体（P＜0.05），压榨损失、熟肉率和剪切力性状在各基因型间差异不显著（P＞0.05）。综上可知，T等位基因对滴水损失可能有一定的负面影响，而对p H1则可能有一定的正面影响。

表11-6 LPL基因A384T位点不同基因型对肉质性状的影响

注：此表中的数值为“平均值±标准差”；同排数字后不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

⑥ LPL基因A384T位点多态性与脂肪酸及氨基酸含量的关联性分析

由表11-7可知，东北肉羊LPL基因A384T位点各基因型与肉豆蔻酸及棕榈酸存在相关性：TT型肉豆蔻酸值显著低于TA型和AA型（P＜0.05）；TT型棕榈酸值显著低于TA型（P＜0.05），与AA型则差异不显著（P＞0.05）；其余脂肪酸在各基因型间差异不显著（P＞0.05）。这表明T等位基因对肉豆蔻酸和棕榈酸含量可能有一定的负面影响。

由表11-8可知，东北肉羊LPL基因A384T位点各基因型与甘氨酸及精氨酸存在相关性：TT型甘氨酸含量显著高于TA型（P＜0.05），与AA型差异不显著（P＞0.05）；TT型精氨酸含量显著高于TA型和AA型（P＜0.05）；其余氨基酸含量在各基因型间差异不显著（P＞0.05）。这说明T等位基因对甘氨酸和精氨酸含量可能有一定的正效应。

表11-7 LPL基因A384T位点不同基因型对脂肪酸含量的影响

注：此表中的数值为“平均值±标准差”；同排数字后不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

表11-8 LPL基因A384T位点不同基因型对氨基酸含量的影响

注：此表中的数值为“平均值±标准差”；同排数字后不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

5．讨论

（1）关于LPL基因ORF的生物信息学分析

在得到LPL基因c DNA测序结果后，通过DNAstar软件的Edit Seq程序将起始密码子、终止密码子及ORF的位置进行确定，并对ORF进行生物信息学分析，推导其编码的氨基酸序列。分析结果表明，东北肉羊LPL基因ORF全长为1437 bp，共编码478个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。将东北肉羊LPL基因c DNA序列提交到NCBI数据库，利用Blast程序与另外8种动物进行比对后发现东北肉羊与绵羊、山羊等8种生物的LPL基因c DNA序列相似性为85.1%～99.8%。将LPL基因编码的氨基酸序列与这8种动物进行比对，发现与他们的氨基酸序列同源性为89.3%～100.0%。这和高思等对藏绵羊与牛、猪等11个物种的LPL基因序列及编码氨基酸序列之间相似性比较结果相一致，说明羊与牛在进化过程中有更近的亲缘关系，而与鼠的亲缘关系较远。

（2）关于SNPs位点的筛查

SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性），是指在基因组水平上的由单个核苷酸变异所引起的DNA序列的多态性，包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失等形式。正是由于SNP具有总数目多，在各物种DNA中分布广泛，适于迅速、大规模的筛查，等位基因频率容易估计，易于进行基因分型等特点，所以已被作为第三代遗传标志。筛选SNPs的方法有多种，如直接测序（Sequencing）、单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism， SSCP）、限制性长度多态性（Resection fragment length polpoorphism， RFLP）、等位基因特异性PCR（allele specific PCR）、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele specfic oligonucleotide hybridization，ASO）、异源双链分析（Heteroduplex Analysis， HA）、基因芯片技术（gene chips）等。由于生物选择性进化的原因，SNP位点的变异并不会在短时间内大量出现，而是在长期的进化中逐渐累积起来的，且在基因内分布不均匀，位于编码区内的SNPs与非编码区相比较少，多是同义突变。

在以前的分子实验中，由于测序费用昂贵，一般是先酶切分型后选择代表性样品送去测序以节省经费；而随着现代分子技术的发展，测序费用已大大降低，因此根据本试验的实际需要，并参考了王兴平等的实验方案，设计了先挑选部分样本进行测序筛查SNPs，再用特定的限制性内切酶酶切PCR产物的SNP位点的实验方案。编码区中的第3、4、5和6外显子主要与酶底物结合区和催化活性中心有关，由于时间与经费限制，本试验只对这部分外显子进行SNPs筛查，并未对其余外显子和非编码区部分进行筛查。这是在参考其他文献对这部分外显子SNPs位点的研究后做出的选择，而位于非编码区内的SNPs位点对生物性状的影响一般不大，故先不做研究，留待以后进行。

（3）关于LPL基因多态性分析

在对东北肉羊LPL基因第3、4、5和6外显子上的SNPs位点完成筛选后，共发现3个SNP位点，分别处于第3外显子和第4外显子内，都是同义突变，而第5和6外显子上则并未发现SNP位点。由于其中2个SNP位点没有找到合适的限制性内切酶对其进行酶切分型，而A384T位点可被Pst I限制性内切酶识别，因此本试验只对此SNP位点进行了酶切与基因分型。

酶切分型结果表明，A384T位点AA基因型频率最大，TT基因型频率最小，TA基因型则介于这二者之间，A为优势等位基因。该位点的多态信息含量为0.2392，结合其他数据表明东北肉羊群体在此位点处于低度多态（PIC＜0.25），遗传变异较小。而χ2-Hardy-Weinberg平衡检验结果表明，在该位点东北肉羊群体已处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05），这说明该群体LPL基因仍处于动态平衡之中，对应的基因型在遗传与适应性等方面具有优势，人工选择育种对其影响较小。

（4）关于SNP与肉质性状的关联分析

在对A384T位点进行酶切分型后，将各基因型与p H1、滴水损失、压榨损失、熟肉率、嫩度等肉质性状进行关联性分析，结果表明该位点TT型滴水损失极显著高于TA型和AA型 （P＜0.01），TT型p H1值显著高于TA型 （P＜0.05），与AA型则差异不显著（P＞0.05），而压榨损失、熟肉率和剪切力性状在各基因型间差异不显著（P＞0.05）。由此推测，T等位基因对滴水损失可能有一定的负效应，而对p H1则可能有一定的正效应。

TT型肉豆蔻酸含量显著低于TA型和AA型（P＜0.05），TT型棕榈酸含量显著低于TA型（P＜0.05），与AA型则差异不显著（P＞0.05），其余脂肪酸在各基因型间差异不显著（P＞0.05）。由此推测T等位基因对肉豆蔻酸和棕榈酸含量可能存在一定的负效应。脂肪酸是羊肉风味的重要前体物质，是形成羊肉风味的重要化学基础，与烹饪过后产生的香味有密切联系，本研究的结果可为改善羊肉风味、生产高品质羊肉提供参考。

TT型甘氨酸含量显著高于TA型（P＜0.05），与AA型差异不显著（P＞0.05）；TT型精氨酸含量显著高于TA型和AA型（P＜0.05）；其余氨基酸含量在各基因型间差异不显著（P＞0.05）。由此推测，T等位基因对甘氨酸和精氨酸含量可能存在一定的正效应。游离氨基酸是构成肉香及鲜味的重要物质，绝大多数游离氨基酸与火腿风味的相关达显著和极显著水平。本研究发现A384T位点TT型对甘氨酸和精氨酸均有一定的正面影响，说明LPL基因对氨基酸含量存在一定的影响进而影响到肉的风味。

一直以来，人们普遍认为同义突变不会影响到DNA所翻译蛋白质的结构与功能，但Gene-Wei Li等在对蛋白质合成速度的研究中发现轻微的遗传改变都有可能会对蛋白质的合成速率产生巨大影响，包括同义突变。这是因为同义突变改变了氨基酸的合成速度，新的肽链结构也可能发生变化，从而影响了转录活性和细胞定位，导致生产性能变化。这种看似不明显的遗传变化甚至能将蛋白质的合成速率减慢到正常速度的1/10以下，从而对部分生物性状造成影响。另外，根据王晓菲（2013）的研究结果，同义突变还可以通过改变基因的密码子使用偏性、m RNA二级结构稳定性、m RNA剪接以及mi RNA靶标识别等机制影响基因的表达，从而最终引起生物性状的改变。本试验的结果与这些研究较一致，这也提醒我们以后在进行此类关联分析时若遇到SNP位点同义突变不应轻易放弃对其的研究，它们与错义突变一样可能会对生物的性状造成显著影响。

目前，关于羊LPL基因多态性与肉质性状相关性的研究很少，而在对其他家畜LPL基因的研究中，张振波（2005）对大白×梅山F2代的LPL基因c DNA序列进行测定并研究其内含子SNPs位点与部分性状的关联性；王文涛等（2009）使用PCR-RFLP技术，对大白猪、东北民猪、杜洛克和长白猪4个猪种的LPL基因的多态性进行了检测；郭艳青（2007）通过PCR-SSCP技术对牛LPL基因进行了多态位点检测，发现牛LPL基因第2、5、6、8、9外显子及第l内含子上存在多态位点；王兴平等（2012）采用创造酶切位点的PCR-RFLP技术对湘西黄牛LPL基因第2外显子进行了SNPs检测，并分析了突变位点各基因型与湘西黄牛生长性状间的关联性。这些研究都表明LPL基因的多态性与畜禽的部分肉质性状和生长性状有着密切的相关性，本试验的结果与其较为一致。因此，进一步开展对羊LPL基因的研究，对于深入了解该基因的功能，寻找有利的分子标记位点，将分子标记应用于育种实践，进行标记辅助选择具有重要意义。