-基因单核苷酸多态性及其与肉用性状的关联分析

脂肪酸结合蛋白（Fatty acid binding protein， FABP）是一类分子量仅为14～16k Da胞内小分子蛋白，均含有126～137个氨基酸，同源性为38%～70%。FABPs在动物机体多种组织中均有表达。FABPs可以分为两类：一类是与质膜有关的（FABPPM），另一类是细胞内或细胞质蛋白（FABPC）。目前已发现多种类型的FABPs，如心型（Heart， H-FABP）、肠型（Intestinal， I-FABP）、肝型（Liver， L-FABP）、回肠型（Ileal，Il-FABP）、脂肪细胞型（Adipocyte， A-FABP）、表皮型（Epidermal，E-FABP）、髓磷脂型（Myelin， M-FABP）、睾丸型（Testis， T-FABP）和脑型（Brain，B-FABP）。FABPs能促进脂肪酸从细胞膜运送到脂肪酸氧化、甘油三酯或磷脂上脂肪酸酯化的位点。此外，FABPs也参与脂肪酸在脂肪细胞中的双向运输。FABPs的另一功能是保护细胞免受细胞内高浓度游离脂肪酸的毒害作用，并且调节（长链）脂肪酸与其他配体的活动，因此，它可以影响酶、细胞膜、受体、离子通道或基因。Glatz等（1996）报道了FABPs在调节脂肪酸依赖型细胞信号转导方面的作用。由于FABPs在细胞内对脂肪酸的吸收与运输方面起到重要作用，所以我们可将FABPs作为影响肌内脂肪含量的候选基因。

心脏型脂肪酸结合蛋白（Heart Fatty Acid-Binding Protein，H-FABP），也被称为FABP3，可在肌肉、血管、脉管、内脏、神经、生殖等多种高度需求脂肪酸进行代谢的组织器官中表达。H-FABP主要在脂肪代谢中起作用，参与长链脂肪酸的摄取或利用，把脂肪酸从细胞膜运输到线粒体β氧化的位点。此外，通过与脂酰辅酶A和酰基-L-肉碱绑定的长链脂肪酸胞内运输，H-FABP基因也参与了胞质疏水配体结合蛋白和脂质代谢。一些研究认为，H-FABP的功能包括细胞信号转导，生长抑制，脂肪细胞分化，在脂肪生成中间阶段对脂肪酸的运输和脂肪沉积也有重要作用。

目前，在猪、鸡、牛、羊等畜禽品种中均对H-FABP基因进行了克隆、定位及其基因多态性与经济性状相关性等研究。Gerbens等（1999）利用PCR-RFLP法对983头杜洛克猪H-FABP基因进行分析，结果表明，HH型比hh型个体的IMF含量高约0.4%，单倍体aadd HH与高肌内脂肪含量（IMF）有关。Gerbens等（2000） 研究表明H-FABP遗传多态性对梅山猪和国外品种杂交F2代猪肌内脂肪含量有显著作用，因此可以作为肌内脂肪含量遗传标记的候选目标基因。

王存芳（2002）研究发现H-FABP不同单倍体对猪肌内脂肪含量有显著相关。林万华等（2003）利用PCR-RFLP方法对二花脸猪的初生重、20日龄体重、断奶重及肌肉组织学特性的相关性状进行了分析。结果表明，不同基因型间20日龄体重差异显著（P<0.05），但对初生重、断奶重和肌肉粗脂肪含量无显著影响，这些性状均表现为HH>Hh>hh。庞卫军等（2005）利用PCR-RFLP技术检测了9个品种猪H-FABP基因在5’上游区和第二内含子上的遗传变异及其对IMF含量的遗传效应。结果发现基因型aa-dd-HH与IMF含量之间存在显著性关系。李长龙等（2006）研究发现H-FABP基因多态性与苏太猪、梅山猪和杜×长×大猪等群体IMF含量有显著的相关。李武峰（2004）和周国利（2005）均利用PCR-RFLP方法在3个杂交牛种和鲁西黄牛的H-FABP基因的第Ⅱ内含子上发现了 1个 HaeⅢ变异酶切位点，纯合基因型显著影响嫩度（P＜0.05），但滑留帅等（2007）利用相同方法在固原本地黄牛及其利杂群体中未发现上述结果。文力正（2008）等利用PCR-SSCP技术对含1/2利木赞血缘的改良草原红牛的H-FABP基因5’-调控区进行SNP检测，结果发现：在136位点发生了T碱基的插入突变，在142位点发生了G→A转换。相关分析结果显示A基因对剪切力有负效应，不同基因型对其他肉质性状的影响均不显著，由此表明H-FABP基因对肉质嫩度有显著影响。

余刚等（2007）利用PCR-SSCP技术对陕北白绒山羊H-FABP基因第2外显子进行了SNP分析，结果发现该座位存在1个突变位点（G→C），且该群体处于Hardy-Weinberg非平衡状态；相关分析结果表明AB与AA和BB基因型在背膘厚方面存在显著性差异（P<0.05），AA和BB型之间差异极显著（P<0.01）；AB和BB型个体的胸围和管围呈显著性差异（P<0.05），AA和BB型个体的眼肌面积具有显著差异（P<0.05）；另外，在初生重、眼肌面积等六性状上均表现AA>AB>BB，在胸围等三性状上均表现AB>AA>BB，因此H-FABP基因可以作为陕北白绒山羊生长及胴体性状的候选基因以及绒山羊肉用性能的分子标记。HUANG ZHI-Guo等（2006）利用荧光实时定量PCR法在30-90日龄哈萨克羊群体中发现H-FABP转录水平与肌内脂肪含量极显著正相关（r=0.737，P<0.01）。康康（2008）用半定量RT-PCR方法90～160日龄蒙古羊群体中也得到了类似的结果。乔海云等（2009）采用PCR-SSCP方法对H-FABP基因外显子2-4和3’调控区进行筛查，共检测到4个多态位点，同时发现该基因多态位点与IMF含量显著相关（P＜0.05）。

为了深入了解影响羊肉品质的遗传机制，找出影响肉质性状的相关基因，本试验以东北细毛羊、小尾寒羊、杜泊和道赛特4个品种（群）为研究对象。利用PCR-SSCP及FQ-PCR技术对H-FABP基因进行分析，研究不同品种间的遗传变异情况及组织表达差异，并通过与肉质性状的相关分析找出与肉质性状的连锁关系，以期用于分子标记辅助选择，进行早期选育，提高肉用品质，为今后肉羊品种的选育工作提供参考。

1．试验材料

（1）试验动物

选取6月龄体重相近的杜泊×小尾寒羊49只，进行肥育试验统一标准饲养于吉林省农业科学院畜牧科学分院，颈静脉采血10 m L左右，ACD抗凝，-80 ℃冷冻保存。饲养9个月后选取29只进行屠宰，并测定肉质性状。另采取来自吉林省农业科学院畜牧科学分院实验羊场的东北细毛羊43只、小尾寒羊51只、杜泊15只、道赛特15只的颈静脉血10 m L，ACD抗凝，-80℃冷冻保存。采取3只杜泊×小尾寒羊杂交羊的不同组织样（包括内脏器官组织：心脏、脾、肺、肝脏、肾脏、十二指肠；不同部位肌肉组织：背最长肌和腿部半腱肌），以液氮将采集样品急速冷冻，立即储存于-80 ℃冷冻柜。

（2）试验药品、主要仪器设备、常用分析软件

见第三章相关内容。

2．实验方法

（1）基因组DNA的提取及浓度、纯度测定

见第三章相关内容。

（2）引物选择与设计

参考相关文献，根据Gen Bank发表的序列（Gen Bank登录号：AY157617）设计引物。引物所对应的扩增范围分别包含第2、3、4外显子，引物由上海英俊生物公司合成。

表11-31 H-FABP基因引物

（3）PCR-SSCP检测

方法见第三章

（4）目的片段的克隆与序列测定

目的DNA片段的克隆测序过程包括：感受态细胞的制备、Amp+LB培养基的配备、PCR产物的回收、回收产物的连接、转化、阳性菌液的培养、测序。具体方法见第三章。

（5）基因的组织表达

①总RNA的提取、反转录

方法同前第三章。

②荧光定量PCR引物设计

根据已知的绵羊H-FABP基因（Gen Bank登录号：NM_001267884）及β-actin基因（Gen Bank登录号：NM_001009784）序列，用Oligo7.0软件进行引物设计。设计的引物和内参序列见表2。

表11-32 目的基因及内参基因的引物

③ H-FABP基因标准曲线及熔解曲线建立

以c DNA为模板进行PCR，反应条件为95℃ 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 7 min。PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，回收产物连接T载体转化感受态细胞，并进行质粒提取，作为标准品重组质粒。用超纯水将质粒溶液先稀释10倍，再做51、52、53、54、55的梯度稀释，然后以稀释的不同梯度标准品为模板，与待测样品同时进行荧光定量PCR扩增。用Lightcycler 480荧光定量 PCR 仪自带软件建立双标准曲线。为排除形成引物二聚体及非特异性扩增产物对SYBR Green I Real-time PCR 结果造成的影响，在PCR后进行熔解曲线分析，以确定得到的产物是否为目的产物，95℃ 5 s，65℃ 1 min，然后温度以5℃/s 的速率从65℃递增到97℃，最后温度降到50℃ 30 s，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。然后计算各个样品的表达量。

④荧光定量PCR反应体系及条件

表11-33 PCR体系及组成

PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 10 s，57℃ 30s，72℃ 20 s，共45个循环。 95℃ 5 s，65℃ 1 min，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到97℃，最后温度降到50℃ 30 s。

⑤组织表达差异分析

根据荧光定量检测结果，使用Roche Lightcycler 480的相关软件对所得数据进行差异表达分析。

（6）统计分析

①肉用性状测定

肉用性状指标包括：屠宰性状（胴体重、净肉重、屠宰率、净肉率和眼肌面积）、肉质性状（p H值、失水率、熟肉率、剪切力）。测定方法见第二章。

脂肪酸和氨基酸含量分析由吉林省农业科学院农业资源与环境研究所协助完成。

②遗传参数估计

根据测序结果寻找H-FABP基因SNP位点，同时根据H-FABP基因的SSCP分型结果判定基因型，进行遗传分析，主要包括：基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡符合度的检验、遗传纯合度（Ho）、遗传杂合度（He）、遗传均质度（H.I.）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC），分析方法见第三章。

③生产性状关联分析

在所研究的不同绵羊品种群体中对H-FABP基因分型后，以不同基因型为标记效应组成固定模型，利用SPSS 13.0统计软件对各生产性状进行方差分析，不同标记基因型之间肉质性状指标（平均值±标准差）进行差异显著性检验和多重比较。

建立基因型效应分析模型：

Yij＝μ＋markeri＋eij

其中：Yij：个体表型的记录值；μ：群体平均值；markeri：标记基因型效应；eij：随机误差。

3．结果与分析

（1）血液基因组DNA提取检测结果

提取的血液基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰且无拖带、亮度较高，DNA质量完好，可以用于下一步实验。

图11-35 绵羊血液基因组DNA电泳图

（2）H-FABP基因PCR扩增结果

分别对覆盖第2、3、4外显子的三个位点进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现扩增产物的大小与预期一致，无非特异性条带，可以用于SSCP分析。

图11-36 H-FABP基因第2外显子PCR扩增电泳检测图

图11-37 H-FABP基因第3外显子PCR扩增电泳检测图

图11-38 H-FABP基因第4外显子PCR扩增电泳检测图

（3）PCR-SSCP检测结果及克隆测序结果

经过PCR-SSCP检测，H-FABP基因第2、3外显子在4个群体（东北细毛羊、小尾寒羊、杜泊、道赛特）中均存在多态现象，第4外显子不存在多态现象。然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果选择扩增效果好的纯合子个体，进行胶回收并测序。测序结果分别与Gen Bank公布的H-FABP基因序列进行比对。

① H-FABP基因第2外显子遗传变异

4个绵羊品种的基因分型结果相同，分别定义为AA、BB和AB三种基因型。利用DNAStar 7.0软件与绵羊H-FABP基因序列（Gen Bank登录号：AY157617）比对发现，AA基因型与BB基因型均在777位置发生碱基C缺失。AA基因型在1013处发生A→C突变，BB基因型在第939处、980处和1018处分别发生了A→G、G→A和T→C的单碱基突变。

图11-39 H-FABP基因第2外显子PCR产物的SSCP检测结果

图11-40 4个绵羊群体与参考序列比对

图11-41 AA型与Gen Bank发表序列的比对

图11-42 BB型与Gen Bank发表序列的比对

② H-FABP基因第3外显子遗传变异

利用DNAStar 7.0软件与绵羊H-FABP基因序列（Gen Bank：AY157617）比对发现，4个绵羊群体均在2884位置发生G→A突变，在2926位置发生G→T突变。4个绵羊品种中，东北细毛羊、小尾寒羊和道赛特只有AB、BB两种基因型，杜泊有AA、BB、AB三种基因型。AA基因型在2878位点、2956位点和3017位点分别发生C→T、C→T、G→A突变，BB基因型则只在2956位点发生了C→T突变。

图11-43 4个绵羊群体与参考序列比对

图11-44 H-FABP基因第3外显子PCR产物的SSCP检测结果

图11-45 AA型与Gen Bank发表序列的比对

图11-46 BB型与Gen Bank发表序列的比对

③ H-FABP基因第4外显子遗传变异

经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现，H-FABP基因第4外显子不存在多态性。

图11-47 H-FABP基因第4外显子PCR产物的SSCP检测结果

（4）H-FABP 基因的组织表达

①总 RNA 的提取与检测

用 Trizol法提取不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、背最长肌和半腱肌）中总RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到3条清晰的条带，从上到下依次为 28 S、18 S和5 S，条带边界清晰。经紫外可见分光光度计测定A 260/A 280的值均在1.8～2.0之间，表明RNA质量完好，无蛋白质和其他杂质污染，可用于下一步实验。

图11-48 不同组织总RNA提取结果

②荧光定量的结果

A．标准曲线的建立

RT-PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，回收产物连接T载体转化感受态细胞，并提取质粒，作为标准品重组质粒。用超纯水将质粒溶液先稀释10倍，再做51、52、53、54、55的梯度稀释，然后以稀释的不同梯度标准品为模板进行荧光定量PCR扩增。从5个不同浓度的标准品获得扩增曲线。在检测的5个数量梯度上，Ct值和起始模板稀释数的相关性良好，H-FABP基因和β-actin基因标准曲线的斜率分别为-2.802和-3.195，Error值都小于0.2，扩增效率都在2左右，具有很好的线性关系。

图11-49 H-FABP基因荧光定量PCR标准曲线

图11-50 β-actin基因荧光定量PCR标准曲线

B．熔解曲线分析

各组样本荧光定量PCR前，绘制熔解曲线，以熔解曲线峰值是否一致来检测引物的特异性。从下图可以看出，各样本峰值基本一致，没有杂峰信号出现，扩增产物Tm值非常均一，说明PCR参数选择适当，无非特异性扩增，引物特异性较好。

图11-51 H-FABP基因扩增熔解曲线

图11-52 β-actin基因扩增熔解曲线

C．循环数与荧光强度关系曲线

应用Roche Lightcycler 480荧光定量PCR仪检测H-FABP基因和β-actin基因荧光定量扩增结果并用匹配的程序分析结果。H-FABP基因和β-actin 基因的扩增曲线总体看指数期明显，在此期间，PCR循环数与起始的模板拷贝数成对数关系。相邻浓度标准品的扩增曲线之间的间距比较接近，说明扩增效率高。

图11-53 H-FABP基因荧光定量扩增结果

图11-54 β-actin基因荧光定量扩增结果

D．H-FABP基因在不同组织表达量的荧光定量PCR检测

用Roche Lightcycler 480的相关软件对所得数据进行分析，可以直接得出目的基因和内参基因相对表达量的比值，可以看出H-FABP基因在不同的组织中表达量不尽相同，基因表达量从高到低依次为半腱肌、背最长肌、心、肾、脾、十二指肠、肝、肺。

图11-55 H-FABP基因在不同组织中的表达结果

(5)统计分析结果

①基因遗传变异分析

经SSCP分型肝计算基因型频率和I带位基因频率，4种绵羊群体内H-FABP基因exon 2的基因型频率及等位基因频率差距不大，且呈现相同的趋势，B等位基因为优势等位基因，在东北细毛羊、小尾瘁羊和扯泊中，BB基因型为优势基因型，但在道赛特巾，AB基因型为优势基因型。经卡7市检验发现，4个群体都处于Hardy-wenberg平衡状态。

表11-34 不同绵羊品种H-FABP基因第2外显子的基因型频率和等位基因频草

PIC、H、H.I和lNe分析表明东北细毛羊、杜泊和1道赛特3个群体的事态信.Q、吉盐(PIC)均处于0.25和0.50之间，处于中度事态。小尾寒羊为低度多态(PIC<0.25)。

表11-35 H-FABP基因第2外显子的遗传变异参数

4种绵羊群体内H-FABP基因exon3的等位基因频率呈现相同的趋势，B等位基因为优势等位基因，BB基因型为优势基因型。在东北细毛羊、小尾寒羊和道赛特中，不存在AA基因型，但在杜泊中存在AA基因型。经卡方检验发现，4个群体都处于Hardy－Weinberg平衡状态。

表11-36 不同绵羊品种H-FABP基因第3外显子的基因型频率和等位基因频率

PIC、H、H.I.和Ne分析表明东北细毛羊和小尾寒羊的多态信息含量为低度多态（PIC＜0.25），杜泊和道赛特的多态信息含量（PIC）均处于0.25和0.50之间，处于中度多态。

表11-37 H-FABP基因第3外显子的遗传变异参数

②生产性能连锁分析

在屠宰、肉用性能测定的基础上，对达到统计要求的数据，采用一般线性模型进行了H-FABP基因多态性与肉用性状（肉质性能、屠宰性能、氨基酸含量、脂肪酸含量）的关联分析。

不同肉质性状均值差异显著性检验发现，不同基因型的剪切力存在显著差异，即基因型BB显著低于AB型（P＜0.05），说明基因型BB对剪切力有一定的负面影响。

表11-38 H-FABP基因各基因型肉质性状均值差异显著性检验

注：下标1代表45min所测值；下标24表示24h所测值。同行中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

不同屠宰性状均值差异显著性检验发现，不同基因型的胴体重、净肉重和屠宰率存在显著差异。基因型BB在胴体重方面显著高于AA和AB型（P＜0.05），说明基因型BB对胴体重有一定的正面影响；基因型BB在净肉重性状上显著高于AB型（P＜0.05），说明基因型BB对净肉重有一定的正面影响；基因型AA在屠宰率方面显著低于BB、AB型（P＜0.05），说明基因型AA对屠宰率有负效应。

表11-39 H-FABP基因各基因型屠宰性状均值差异显著性检验

注：同行中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

H-FABP基因不同基因型各脂肪酸性状均值差异显著性检验结果表明，不同基因型的棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸存在显著差异：基因型BB在棕榈酸含量上显著高于AA和AB型（P＜0.05），说明基因型BB对棕榈酸含量有显著的正效应（P＜0.05）；基因型BB在硬脂酸、亚油酸含量上极显著低于AA、AB型（P＜0.01），AA和AB型之间差异不显著，说明BB型对硬脂酸、亚油酸含量有一定的负面影响。

表11-40 H-FABP基因各基因型脂肪酸性状均值差异显著性检验

注：同行中不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母间表示差异极显著（P<0.01）。

H-FABP基因各基因型之间不同氨基酸含量均值差异显著性比较结果发现，不同基因型的谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸含量存在显著性差异。基因型AA、AB在谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸含量以及氨基酸总和上显著高于BB型（P＜0.05），说明BB型对谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸含量、氨基酸总和有一定的负面影响；基因型BB在脯氨酸含量上极显著低于AA、AB型（P＜0.01），说明BB型对脯氨酸含量有一定的负面影响。

表11-41 H-FABP基因各基因型氨基酸均值差异显著性检验

注：同行中不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母间表示差异极显著（P<0.01）。

4．讨论

（1）H-FABP基因的群体遗传多态性

关于H-FABP基因在羊群体的遗传变异研究报道并不多，乔海云等（2009）研究表明，H-FABP基因在不同绵羊品种中具有单核苷酸多态性，检测发现存在981（G/A）、1014（A/C）、1019（T/C） 和1058 （-/G ）4个SNP位点。谢一妮等（2011）采用 PCR-RFLP方法检测了崇明岛山羊群体H-FABP基因部分exon 2及intron 2序列的SNP位点（A1017G、C1115T、G999-）。王兰萍等（2012）利用PCR-SSCP和DNA测序技术对2个江苏地方山羊品种的H-FABP基因进行单核苷酸多态性检测和群体遗传学分析，结果在H-FABP基因exon 2的第132位检测到G/C碱基突变，且该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。本研究在不同绵羊品种中检测到H-FABP基因第2外显子存在939（A/G）、980（G/A）、1013（A/C） 和1018（T/C） 4个SNP位点，这与乔海云的实验结果基本一致，但分型方面有些差异，这可能与品种的差异和样本数量较小有关。

H-FABP基因第3、4外显子的报道很罕见，本研究在不同绵羊品种中检测到H-FABP基因第3外显子存在2878 （C/T）、2956 （C/T）和3017 （G/A） 3个SNP位点。而第4外显子没有发现突变位点，可能是样本数量有限的原因。存在多态的两个位点在4个群体中均处于Hardy－Weinberg平衡状态，这表明长期的人工选择未对该处基因产生影响。

（2）群体遗传变异

生命进化过程中，由于育种目的、环境或外界其他因素等的改变而使物种本身发生遗传性的改变。多态信息含量（PIC）、遗传均质度、纯合度、杂合度、有效等位基因数等都是表示某群体遗传变异性的重要量化指标，它们从不同的角度衡量群体的遗传变异水平。PIC是表示遗传标记变异程度高低的一个指标，本研究e2位点东北细毛羊和小尾寒羊的多态信息含量为低度多态（PIC＜0.25），杜泊和道赛特的多态信息含量（PIC）均处于0.25和0.50之间，处于中度多态。e3位点东北细毛羊、杜泊和道赛特3个群体的多态信息含量均处于中度多态，小尾寒羊为低度多态（PIC＜0.25）。总体来说各品种遗传变异程度不是很大。均质度（H.I.）能反应群体的一致性。H.I.越大，群体的一致性越高、遗传变异越小。本研究中e2、e3位点中小尾寒羊的H.I.均高于其他品种，同时小尾寒羊的杂合度都低于其他品种，充分说明其群体一致性好。

（3）H-FABP基因与肉用性状的关联分析

目前H-FABP 基因与肉质性状的关联分析多见于猪和鸡上。Gerbens等发现， H-FABP基因的不同基因型与猪IMF含量显著相关，因此，H-FABP基因可能是猪IMF的潜在候选基因。国内多个研究团队的结果表明地方品种和国外品种猪群体中H-FABP基因的多态性与IMF含量显著相关。李武峰等（2005）、周国利等（2005）和文力正等（2008）在不同品种的牛群体中发现H-FABP基因多态性对嫩度有一定影响；余刚等（2007）的研究表明H-FABP基因可以作为陕北白绒山羊生长及胴体性状的候选基因以及绒山羊肉用性能的分子标记；HUANG ZHI-Guo等（2006）、康康（2008）检测了不同品种和日龄的绵羊H-FABP基因转录水平的变化及与IMF含量的相关性，发现不同日龄的绵羊中H-FABP基因转录水平与IMF含量显著相关。乔海云等（2009）研究了绵羊H-FABP基因的多态性及其对IMF含量的影响，结果发现， H-FABP基因的多态性与IMF含量有显著的相关性。

本研究进行了H-FABP基因多态性与肉用性状的关联分析，并发现了一些与生产性状相关的基因型，BB基因型对剪切力有显著的负效应，基因型BB对胴体重、净肉重有一定的正面影响（P＜0.05），基因型AA对屠宰率有负效应（P＜0.05）。基因型BB对棕榈酸含量有显著的正效应（P＜0.05），基因型BB型对硬脂酸、亚油酸含量有极显著的负效应（P＜0.01）。基因型BB对谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸含量以及氨基酸总和均有一定的负面影响（P＜0.05），对脯氨酸含量有极显著的负效应（P＜0.01）。这些研究结果可以作为H-FABP在分子育种中应用的参考。

不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸和亚麻酸等）含量与肌肉风味和营养价值显著相关。本研究中在肌肉组织中不饱和脂肪酸的含量高于饱和脂肪酸的含量，这可能是羊肉特有风味的物质基础。饱和脂肪酸的含量主要取决于棕榈酸和硬脂酸的含量，棕榈酸的含量与多汁性呈负相关；硬脂酸可引起羊肉的膻味，并且随着含量的升高而增加。本研究对不同基因型的脂肪酸含量进行了研究，不同基因型的棕榈酸、硬脂酸和亚油酸含量存在显著性差异，其结果对进一步研究H-FABP基因与脂肪酸含量的关系奠定了一定的基础。

H-FABP基因各基因型之间不同氨基酸含量显著性比较结果发现，不同基因型间的谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量以及氨基酸总和存在显著性差异，这说明H-FABP基因对氨基酸的含量有一定的影响。氨基酸中丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸是形成肉香味所必需的前体氨基酸，尤其谷氨酸是肉中最主要的鲜味物质，本试验中不同基因型的谷氨酸含量最高，而谷氨酸可增加羊肉的鲜味和香味。

通过这些与生产性状有显著相关的位点进行标记辅助选择，将可能导致经济性状的性能产生遗传反应，但由于试验方法及判型标准、统计方法的不同，许多结论存在一些差异，这就需要尽快寻求一种更为灵敏通用的检测方法及分析手段去进一步验证，以获得可靠的数据用于生产。

（4）H-FABP基因的组织表达差异

H-FABP主要在脂肪代谢中起作用，参与长链脂肪酸的摄取或利用，把脂肪酸从细胞膜运输到线粒体β氧化的位点。此外，通过与脂酰辅酶A和酰基-L-肉碱绑定的长链脂肪酸胞内运输，H-FABP基因也参与了胞质疏水配体结合蛋白和脂质代谢。一些研究认为，H-FABP的功能包括细胞信号转导，生长抑制，脂肪细胞分化，在脂肪生成中间阶段对脂肪酸的运输和脂肪沉积也有重要作用。H-FABP可在许多组织中表达，如心肌组织、骨骼肌、平滑肌、主动脉、肾远端小管、肾脏、肺、大脑、胎盘、睾丸、卵巢以及泌乳的乳腺细胞等。但主要是在对脂肪酸有高度需求的组织，如骨骼肌、心肌和泌乳的乳腺中表达。

乔海云等（2009）利用荧光定量PCR法检测绵羊H-FABP基因m RNA在不同组织中相对表达量，结果发现H-FABP基因在心脏和肌肉中表达量较高，肝脏、脾、肾等的表达量次之，肺中的表达量最低。郝称莉等（2008）用荧光实时定量PCR法检测湖羊不同部位肌肉H-FABP基因表达水平，结果表明：随着月龄的增加，背最长肌和腰大肌H-FABP基因m RNA的表达模式基本相同，2月龄达最高（P＜0.01），总体呈现上升-下降-上升的趋势，而股二头肌H-FABP基因m RNA的表达量无显著变化，同月龄H-FABP基因m RNA的表达量在湖羊不同部位肌肉表现有明显的差异。

本研究利用实时荧光定量PCR法检测绵羊H-FABP基因m RNA在不同组织中相对表达量，结果表明：H-FABP基因在不同的组织中表达量不同，在心脏和肌肉中表达量较高，半腱肌中表达量最高，背最长肌和心脏次之，其次为肾、脾、十二指肠和肝脏，肺中的表达量最低，和乔海云的结果基本一致，但是心脏和肌肉的表达量与乔海云的结果不同，这可能与羊的品种和检测手段有关。

5．结论

（1）H-FABP基因第2外显子存在4个突变位点：分别为g.939 A→G、g.980 G→A、g.1013 A→C、g.1018 T→C；第3外显子存在3个突变位点：分别为g.2878 C→T、g.2956 C→T、g.3017 G→A；第4外显子不存在突变位点。

（2）对存在多态的exon2和exon3进行遗传变异分析，结果发现e2、e3位点均处于Hardy－Weinberg平衡状态。e2位点中东北细毛羊、杜泊和道赛特3个群体的多态信息含量（PIC）均处于中度多态。小尾寒羊的多态信息含量处于低度多态。e3位点中东北细毛羊和小尾寒羊的多态信息含量处于低度多态，杜泊和道赛特的多态信息含量（PIC）均处于中度多态。

（3）采用一般线性模型进行了H-FABP基因多态性与肉用性状的关联分析，结果显示：BB基因型对剪切力、胴体重、净肉重、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量以及氨基酸总和有影响；基因型AA对屠宰率有负效应。

（4）利用实时荧光定量PCR检测绵羊H-FABP基因在不同组织中的表达差异，结果显示，H-FABP基因在不同的组织中表达量不同，表达量从高到低依次为腿部半腱肌、背最长肌、心、肾、脾、十二指肠、肝、肺。