1）材料基因型
植物基因型是影响雄核发育的最重要因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导的反应差异较大。如在水稻中，籼稻花粉培养效果远低于糯稻。大多数研究者认为基因型决定单倍体培养的胚产量和质量，是影响单倍体培养的主要因素，这可能是因为不同基因型的花粉小孢子对离体培养的敏感度不同。
2）花粉发育时期
小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。实践表明，适宜时期为单核期，尤其是单核中、晚期（单核靠边期）（见图3.7）。
图3.7 小孢子的发育过程
陈火英等（2005，2010）通过研究小果型番茄花蕾长度及花蕾外部形态与花粉发育时期的相关性，以及花蕾长度对愈伤组织诱导率的影响，最终得出结论：当花蕾长为8～9 mm时（见图3.8），花粉处于单核靠边期（见图3.9），此时花冠略高于萼片，呈黄绿色，花萼基本开裂，花药培养中愈伤组织的诱导频率最高，是小果型番茄花药培养的最适时期（见图3.10）。
图3.8 花蕾伸长过程中外部形态的变化（花蕾长度从左到右依次为3～4，4～5，5～6，6～7，7～8，8～9，9～10，10～11，11～12，＞12 mm）
图3.9 花粉各发育时期的细胞学特征
（a）小孢子母细胞时期；（b）二分体时期；（c）四分体时期；（d）单核早期；（e）单核中期；（f）单核靠边期；（g）二核小孢子时期，箭头表示营养核和生殖核；（h）二细胞花粉，箭头表示营养核和生殖细胞；（i）成熟花粉粒，箭头表示营养核和生殖细胞（标尺=25μm）
图3.10 小果型番茄花药培养
（a）接种3周后白色的愈伤组织突破药壁层；（b）接种4周后愈伤组织增大；（c）置于光下白色的愈伤组织上产生绿色的芽点；（d）接种6周后，分化出不定芽；（e）不定芽生长；（f）不定芽转入生根培养基；（g）完整的再生植株（标尺=5 mm）
3）供体植株的生长条件与生理状态
（1）植株生长条件。光温等因素均会影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较为理想，但物种间存在差异。例如，一直生长在24℃条件下的曼陀罗属植株其雄核发育的频率达到45%，而生长在17℃条件下的仅为8%；而生长在较低温度下的蔓菁（Keller，Stringam，1978）植株的花药反而获得了较好的结果。在对烟草栽培品种“White Burley”研究中发现，如果供体植株生长在14 Klux的光强下8 h，有56.6%的花药有反应，平均每一个花药能产生19.3株；如果生长在同样光强下16 h，则只有39.4%的花药有反应，一个花药平均仅能产生5.8株。可见，花药的反应与光周期长短并不是简单的正相关关系，而是一个比较复杂的互作关系。
（2）植株生长时期。一般来说，初花期优于开花末期。在对曼陀罗、烟草和拟南芥的花药培养中均发现采自始花期的花药雄核诱导率较高，并随着植株年龄的增长而呈下降趋势。1973年，Nitsch在研究曼陀罗的雄核发育时发现取自播种苗的较老植株花药的花粉几乎没有反应。产生这种现象的原因可能是较老植株的花粉育性有所下降。
（3）P花粉的频率。P花粉是指具有胚胎发生潜能的花粉。通过不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理可提高P花粉的数量。另外，对植株的物理处理以及植物激素和矿质元素的应用也会改变植株的生理状况，从而影响雄核的诱导。例如，除去曼陀罗属老花和小麦花序的顶端部分，可提高雄核发育的频率。对花药供体植株进行氮饥饿处理，可以增加烟草属花药的敏感性。
4）培养基
（1）基本培养基。培养基成分不仅决定着花药和花粉培养的成功，还决定着雄核发育的方式。所用的培养基一般随植物种类不同而异，各种培养基如MS，B5，Nitsch，H，N6等都已经在各种不同植物种类中得到应用，其中以MS和N6培养基较为普遍。MS和H培养基适合双子叶植物花药培养；B5培养基适合豆科和十字花科植物花药培养；N6培养基适合禾谷类作物的花药培养；Nitsch培养基适合芸薹属和曼陀罗属等植物。高浓度的NH+4可显著抑制花粉愈伤组织的形成。铁盐对花粉胚状体发育也起到重要的作用。
（2）碳源。碳源包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。培养基中的糖，不仅作为碳源，同时还具有渗透调节的作用等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度有所差异。例如，在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高，但在番茄花药培养中需要量高达14%。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖量要高。对玉米而言，蔗糖效果最好；而对麦类作物而言，则以麦芽糖为最好的碳源。较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
（3）激素。植物生长调节剂对于诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用。细胞分裂素可促进胚状体形成；生长素可诱导愈伤组织形成。细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化成苗。大多数禾本科植物，如水稻、小麦、大麦的花药培养中，外源生长素，特别是2，4-D（1～3 mol/L）是启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织的必要条件。但是，燕麦和玉米除外，它们的花药在没有外源激素刺激的情况下，即能启动细胞分裂。木本植物花药培养要求在分化培养基中同时具有生长素和细胞分裂素，缺少其中之一对小孢子的脱分化均不利。而草本植物花药培养对植物生长调节剂的要求目前没有发现规律。
另外，在培养基中加入某些不定成分能够使花药培养的诱导频率大幅度提高。在培养基中加入活性炭能够有效地提高烟草、银莲花、马铃薯和毛叶曼陀罗等花药的反应。活性炭的这种效应可能是因为它吸收了琼脂本身所固有的或从衰老的花药壁中释放出来的有害物质。在毛叶曼陀罗的培养中发现，加入活性炭的固体培养基比液体培养基的培养效果好，其确切的影响雄核发育的机制还有待进一步研究。
5）培养条件
（1）温度。物种间有差异，培养温度在25～28℃。
（2）光照。光暗交替培养，每天12～18 h的光照，光照强度2 000～10 000 lx。
（3）植板密度。植板密度与花培效率有很大的相关性。5×103～2×104 m L－1密度均能有效培养。一般来说，足够数量但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从而有利于胚状体发生。
6）预处理的影响
通过预处理改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为有胚胎发育潜力的小孢子）。预处理主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线处理等，其中最有效的是低温处理。
（1）高低温处理。大量文献报道，对离体花蕾进行0℃以上低温预处理有助于花粉植株的诱导。在培养前首次采用低温预处理的是曼陀罗花芽，经预处理提高了单倍体植株的诱导频率。低温预处理的温度及持续时间在不同种类材料间存在差异，一般处理温度为4℃左右。深入研究发现，低温可以改变纺锤丝的轴向，破坏纺锤丝的微管蛋白，从而阻止纺锤丝形成，使有丝分裂的正常过程被打破，导致分化过程的发生，并且低温可以在一定程度上抑制花药离体后小孢子的衰败，使小孢子存活的时间延长，从而有更多的小孢子启动雄核发育。但在某些材料的花药培养中，低温预处理不仅无显著效果，甚至起到反作用。有些材料高温处理有效果，烟草（32℃高温处理）、小麦（33℃高温处理）等在花药接种后，先在较高温度下（30～35℃）培养数天，可显著提高小孢子胚胎发育能力。
（2）化学物质处理。包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。
（3）其他。包括γ射线、离心、磁场等。
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