筛选体细胞无性系变异的具体方法

无论是人工诱变还是培养条件下发现的自发的体细胞无性系变异，变异类型繁多，方向不易控制，因此对变异进行有效筛选至关重要。常用的主要筛选方法有：

1）直接筛选法

田间筛选方法较为简单，得到的结果能直观反映变异产生的性状变化，可以对改良的性状作出直观判断，但要注意对生态环境的影响。陈火英等（2000，2002）对通过体细胞突变体筛选获得的番茄耐盐植物后代进行大田鉴定筛选时，取定植于大田的番茄植株的侧枝，扦插于基质槽中，进行盐胁迫处理，根据侧枝的耐盐表现确定相对应植株的“取”或“舍”。这样，既确保了育种材料的传代，又能进行农艺性状的综合鉴定，且不会因为筛选盐处理而对大田土壤环境造成破坏（见图6.2）。

图6.2　利用盐池侧枝扦插进行番茄耐盐性鉴定筛选（陈火英，2000）

2）离体条件选择压力筛选法

通过无性系在组织培养阶段在培养基中加入选择压，选择出有用的抗性细胞系，然后经过再生获得抗性突变体植株。但是，选择压力下的筛选，只是把在组织培养阶段突变的具有目的性状的变异体进行浓缩、集中，其表型在当代细胞或细胞的一定阶段表现为选择压的抗性。但是类型繁多、真正有用的变异体很少，必须将再生植株再在大田中进行性状筛选才能得到具有优良性状且能稳定遗传的新品系。此方法比单纯采用大田筛选节省大量的人力、物力，缩短育种周期。此法已在各种体细胞无性系突变体的筛选中应用。

（1）抗逆细胞突变体的筛选。温度、水分是限制植物地理分布的主要因素，也是作物栽培中最主要的两个影响植物生长的限制因素。用人工形成的低温、干旱、盐碱作为选择压力，可筛选抗逆细胞突变体。采用这种方法，已在番茄、苜蓿、柑橘、水稻、芦苇和小黑麦等植物中得到稳定的抗盐细胞系和再生植株。此外，采用类似的手段，也筛选到了耐旱的高粱再生植株和耐寒的烟草植株。

随着生物技术的发展，现在已能通过遗传工程的方法来培育耐除草剂的作物品种。首先通过基因工程的方法，把耐除草剂基因导入现有作物品种中，然后用除草剂为筛选剂筛选对除草剂具有耐性的突变体。Chaleff和Creason（1985）已筛选到抗毒莠定的烟草组织突变细胞体。

重金属离子是工业污染土壤的一个重要有毒成分。有学者用重金属离子为筛选剂已得到多种耐铝、镉、铜或汞的植物突变体，这对保护工业污染地区的植被有重大意义。

（2）抗病细胞突变体的筛选。植物病毒对植物的毒害作用方式是多样的，而植物的抗性也是由多基因控制的。因此，在组织培养中很难观察到植物体细胞、组织对病毒的抗性作用，难以进行有效、准确的筛选。但是，毒素是致病的唯一因素，且在对植物组织、细胞或原生质体的毒害作用与整体植株一致的情况下，则可以用毒素作为筛选剂筛选抗病的无性系突变细胞，而后再生为植株，从而建立能稳定遗传的有性生殖品系。这方面的经典实验是Carlson于1973年完成的。他用烟草野火病毒素的类似物甲硫氨酸磺（MSO）为筛选剂，筛选到了抗性细胞系，经诱导后形成的再生植株，抗性能稳定遗传。陆维忠等（1998）以小麦赤霉病毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）为筛选剂，对小麦愈伤组织进行抗性突变筛选，最终得到了在无性系阶段及再生植株的后代中能稳定表达的抗性性状，获得了一个抗赤霉病的小麦品系。

（3）氨基酸超量表达的细胞突变体的筛选。在体细胞无性系培养中加入氨基酸或氨基酸类似物，其作用有两个：①在氨基酸生物合成中起反馈抑制作用；②被组入蛋白质中后使酶的作用失活，从而可筛选到对反馈抑制不敏感的突变体，这些突变体可以超量表达某些氨基酸。赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸等氨基酸的合成都是以天冬氨酸为底物，受其末端产物的反馈抑制调控。其中，赖氨酸和苏氨酸是天冬氨酸生物合成途径中的第一个调节酶——天冬氨酸激酶的最有效的协同反馈抑制剂，因此，用氨基酸作为选择剂可以选择出对反馈都不敏感而过量合成赖氨酸和苏氨酸等氨基酸的突变体。人们常用这种方法来提高作物中相对缺乏的氨基酸含量，以改善营养品质。Schaeffer和Sharpe（1981，1987）报道了两例抗氨乙基半胱氨酸和抗赖氨酸的水稻突变体，其种子蛋白中赖氨酸含量和种子贮存蛋白均发生变化。耿瑞双等（1992）采用离体培养方法，选择抗赖氨酸和苏氨酸的玉米突变体，不仅获得了积累游离苏氨酸和赖氨酸的突变类型，还筛选到了种子蛋白质组分发生改变的高蛋氨酸和高赖氨酸突变体，性状遗传稳定，育性正常。

但总的来说这类工作进展缓慢，主要存在着以下问题：①突变体通常育性很差；②突变体大多数仅涉及游离氨基酸水平的变化，而对种子蛋白的影响甚微。